ANEXT安龄生物·细胞外囊泡的表面修饰

ANEXT安龄生物·细胞外囊泡的表面修饰

EV具有生物相容性，具有理想的天然结构和亲水核心。因此，它们越来越多地被用作药物载体或治疗剂，并有望作为临床使用的有价值的纳米载体。尽管它们的表面表达完整的跨膜蛋白（CD81和CD91）和整合素（CD51和CD61），具有归巢和靶向功能，但它们的靶向能力仍然很弱。EV在肝脏和脾脏中表现出大量积聚，随后被巨噬细胞清除。因此，它们的修饰可以促进货物输送到靶细胞。目前的表面功能化策略可分为内源性和外源性两大类。

1、内源性修饰

内源性方法包括在细胞水平上进行工程设计，以通过转染供体细胞产生所需的蛋白质和肽。除了基因操作，生物正交化学也是该策略的重要工具。

2、基因工程

基因工程涉及在体外重组后将外源基因转移到受体细胞中，使得该基因在受体细胞中异位表达。通过MSCs的慢病毒感染获得了表达高水平趋化因子受体4（CXCR4）的外泌体。这些外泌体在肿瘤部位显示出更有效的聚集，攻击肿瘤细胞，在特异性靶向治疗中显示出巨大的潜力。建立了第一辆CD73工程EV。通过慢病毒载体和分离的EV将靶基因转导到人脐带间充质干细胞（HuCMSC）中。这些EV显示CD73表达上调，并在很大程度上降低了炎症反应。构建了一种腺病毒载体，该载体促进心肌营养因子-1（CTF1）的稳定过表达，并在MOI为1时使用该载体将CTF500转导为骨MSC（BMCSc）。研究发现，转导效率在48小时后达到峰值。lncRNA MEG3在许多肿瘤中异常表达，在某些类型的癌症中被敲除。使用pCDNA-MEG3转染骨肉瘤（OS）细胞，并在其分离的外泌体中诱导lncRNA MEG3过表达。证明lncRNA MEG3在骨肉瘤（OS）中起重要作用。体内未观察到显著毒性，表明治疗递送系统有效且安全。使用患者样本和体外研究，发现miR-31-5p是糖尿病创伤生理学中的关键miRNA。因此，用miR-293-31p慢病毒载体转染HEK5细胞，并分离工程化的miR-31外泌体作为精密治疗剂。将Lamp2b引物插入Nhe3和BamH1之间的pcDNA1.1（-）载体中，随后使用电击方法将该修饰的载体转染到HEK293T细胞中。获得了RGD-Lamp2b工程的外泌体，与未修饰的外泌体相比，该外泌体在肿瘤组织中表现出更大的聚集性和更好的肿瘤靶向性。

通过基因工程进行修饰，直接为亲本细胞设计，允许上调核酸表达用于治疗目的。然而，它的成本很高，转染效率不足仍然是一个问题。

3、生物正交化学

生物正交化学是指可以在生物系统内进行而不干扰自然生物过程的化学反应。无铜点击化学方法广泛用于电动汽车的改装。一种使用与叠氮化物共培养的外泌体分泌细胞修饰和功能化外泌体的方法，以使叠氮化物通过生物正交反应与外泌体的化学活性位点结合。使用生物正交点击化学对外泌体进行荧光标记，以实现体内和体外的实时跟踪，首先通过糖代谢工程将叠氮化物基团连接到细胞表面，然后通过生物正交点击化学将荧光DBCO连接到叠氮化物基团。与使用DiD荧光标记的外泌体相比，使用原位生物正交点击化学更有效，毒性更小，对外泌体的内在性质影响较小。将DBCO引入外泌体上的含胺分子中，随后通过叠氮化物部分对c（RDGyK）多肽进行无铜点击化学附着，通过表面修饰改善外泌体靶向。通过无铜化学点击成功地用DBCO-NHS，AF488叠氮化物和荧光标签标记外泌体来量化细胞内跟踪和摄取。

虽然无铜点击化学修饰EV表面的效率低于铜点击化学，但该技术可以防止膜蛋白被铜离子氧化，还可以提高外泌体的安全性。

4、外源性修饰

外源性修饰是指对EVs膜的直接修饰，可以使用物理或化学方法进行。

5、物理改性

物理方法涉及使用物理力和过程，例如超声波，孵育，挤出和冻融方法，以暂时破坏囊泡的脂质结构。通过这些方法，当力消失时，囊泡会自组装成其原始结构。此外，囊泡还可以通过EV和功能分子之间的静电相互作用或弱力（例如脂质膜融合）来修饰。从肝细胞癌（HCC）细胞中分离出肿瘤衍生的EVs（TDEVs），随后将它们与脂质纳米囊泡杂交以获得创新的纳米囊泡（LEV），这些纳米囊泡是由TDEV膜与磷脂融合产生的。由于“归巢”效应和siRNA转染率比脂质体高1.7倍，LEV表现出更好的靶向能力。利用了Gp64在Sf9昆虫细胞病毒颗粒中的存在及其在酸性条件下的膜融合。分离出Sf9昆虫细胞EVs，其表面也表达功能膜蛋白PD-1，可以被Cx43主动靶向。表达Gp64的PD-1 EV与小分子脂质体的融合有助于产生具有进一步生物医学应用的杂合EV。设计了一种新型pH敏感的生物纳米质纳米系统，该系统由SKOV3-CDDP衍生的外泌体通过膜融合技术与cRGD肽修饰的脂质体杂交而成。在真空涡旋中涡旋超声处理后，用脂质体涡旋外泌体，最后使用200nm聚碳酸酯膜过滤器挤出。可以实现包括同源靶向和cRGD在内的双靶向效应。提出了通过将成纤维细胞衍生的外泌体（E）与负载有氯膦酸盐（CLD）的脂质体（L）挤出来制备EL-CLD杂交体和EL-CLD具有良好的药物释放潜力。使用冻融方法将温度敏感的脂质体与基因工程外泌体混合。将混合物在-80°C下冷冻15分钟，并在37°C下重新加热15分钟。157个循环后，获得脂膜融合纳米囊泡（hGLV）。开发了一种在PEG存在下将EV与功能化脂质体融合并保留EV天然特性的方法。异质EV的药物递送效率是游离药物和脂质体递送的4-158倍将小鼠巨噬细胞衍生的J1A.159 sEV与脂质体杂交，以获得工程杂交外泌体（HEs），该外泌体保留了靶向肿瘤部位的内源性sEV和脂质体的优势，脂质体作为潜在的药物递送载体对表面修饰表现出显着的灵活性。可以克服这两种颗粒的缺点，并结合它们的优点，以产生有效的混合药物递送工具。使用阳离子支链淀粉多糖通过静电相互作用修饰外泌体。将血小板膜与干细胞来源的外泌体杂交，以增强受损组织中的结合和积累。通过血小板膜与骨髓MSC衍生的EV融合制备血小板样膜，使用挤出来提高靶向病变部位的能力。

通过物理方式对EV表面进行改性，避免了外来杂质的引入，提高了EV的纯度，同时减少了对EV的损害。但是，在制备过程中往往需要一些复杂的辅助设备。此外，挤压方法可能导致EV尺寸的变化。

6、化学改性

一些官能团存在于EV和EV分泌的细胞跨膜蛋白中。因此，可以使用将官能团添加到EV表面的化学试剂通过共价偶联进行化学改性。由于EVs膜的疏水性，也可以插入功能化的磷脂。生物偶联方法和其他类似的策略也存在。利用生物偶联化学构建了外泌体纳米载体。首先，将DSPE-PEG2000-Mal与细胞孵育48小时。随后，提取带有DSPE-PEG2000-Mal的外泌体，并通过超声处理将siRNA加载到外泌体中。最后，通过DSPE-PEG2-Mal桥结合加入An2，An2000功能化外泌体对胶质母细胞瘤的治疗安全有效。使用点击化学用血管靶向肽（DA164R）和干细胞募集因子（SDF-2）修饰M7小胶质细胞分泌的EV表面。首先，通过酰胺反应将叠氮化物基团引入DA1R肽和SDF-7上。随后，二苯并环辛炔（DBCO）-DBCO封端的聚乙二醇化N-羟基琥珀酰亚胺酯（DBCO-PEG1-NHS）与EVs膜蛋白的氨基反应，实现EVs修饰。最后，采用无铜叠氮化物-炔烃环加成反应制备了DA4R和SDF-7改性的功能化EV。神经干细胞的增强募集为使用点击化学EV治疗疾病提供了新的见解。通过磺酰叠氮化物的环加成用RGE修饰外泌体。通过使用疏水插入方法将DMPE-PEG-CREKA插入脂肪MSC的sEVs膜中，在诱导治疗效果的同时保持sEVs活性，从而获得了CREKA功能化的sEVs（CREKA-sEVs）。将羟基封端HSPP与DSPE-PEG-MAL偶联，合成的HSSP-PEG-DSPE的DSPE末端插入外泌体的磷脂膜中。通过多巴胺（PDA）的自聚合成功地将PDA包封到外泌体中，PDA也具有儿茶酚和胺基团，并与PEG-SH进行硫醇-迈克尔加成反应，得到荧光标记的外泌体。二酰脂尾修饰的骨靶向多肽通过疏水相互作用锚定到外泌体膜上。使用温和的还原剂TCEP来减少EVs表面上的二硫键，然后使用硫醇-马来酰亚胺偶联反应将所需的荧光标记或配体附着到EV表面。

使用化学方法进行功能化相对方便快捷。然而，引入新化学品是否会破坏EV的完整性，以及化学品本身是否具有良好的生物相容性，值得进一步研究。

综上所述，EV的功能化旨在有效增强其预期效果，弥补天然EV的不足，提高靶向能力和药物递送，在诊断和治疗中实现更广泛的应用。然而，EV在功能化后的结构是否完好无损仍然是一个问题。

（ANEXT安龄生物科技研发中心）