科研丨Microbiome(IF:15.5): 口腔癌患者治疗前后唾液微生物组分析

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   口腔鳞状细胞癌(OSCC) 的治疗引入了新的口腔生态环境。预计这将导致口腔微生物组的变化。本研究旨在获得OSCC患者唾液微生物组的新信息以改善OSCC患者的治疗后护理。本研究的目的是调查OSCC患者在癌症治疗前后唾液微生物组谱的可能变化，并将这些变化与健康对照进行比较。本研究收集了99例OSCC患者接受手术切除肿瘤和其他辅助治疗前的唾液样本，并测量了唾液流率。治疗后，28例OSCC患者接受复查，平均随访时间为48个月。此外，对101名健康对照进行了检查和采样。DNA提取纯化后，扩增16S rRNA基因V4高变区，使用Illumina MiSeq测序。使用描述性统计方法研究OSCC患者治疗前后以及与健康对照组比较时微生物谱的差异。结果显示，基线时，OSCC患者中被分类为咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、Abiotrophia defectiva、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的zOTUs相对丰度较高。OSCC患者与健康对照组的微生物谱差异显著(F=5.9，p<0.001)。随访时OSCC患者唾液微生物组α多样性降低，微生物谱与治疗前(p<0.001)和健康对照组(p<0.001)差异显著。综上所述，与健康对照组相比，OSCC患者的唾液微生物组潜在致病菌丰度更高。OSCC治疗导致唾液微生物组α多样性显著降低，微生物组变异性增加，这在几年后的随访中仍然很明显。OSCC患者可能从预防措施中获益，例如使用益生元或益生菌、唾液替代品或膳食咨询。    

论文ID

原名：Salivary microbiome profiles of oral cancer patients analyzed before and after treatment

译名：口腔癌患者治疗前后唾液微生物组分析

期刊：Microbiome

IF：15.5

发表时间：2023.8

通讯作者：Anna I. Mäkinen

通讯作者单位：芬兰赫尔辛基大学医院

DOI号：10.1186/s40168-023-01613-y

实验设计

结果

研究人群的基本特征如表1所示。各组在吸烟方面存在偏倚，因为癌症组的吸烟者多于对照组(卡方检验，p<0.001)。在微生物组分析中，子样品数据集包括857个zOTUs，代表11个门和137个属或更高的分类群。 

表1. 基线时OSCC患者和健康对照组的基本特征。

1.患者与对照组的比较

子样品数据集包括来自99名治疗前OSCC患者和101名对照组的样本。图1显示了OSCC组和对照样品之间的比较。首先，对所有患者和对照组的zOTU结果进行研究并相互比较，没有校正协变量(“偏倚”数据)。两组微生物谱差异具有统计学意义(PERMANOVA，F=5.9，p<0.001)，但Shannon多样性指数无显著差异(独立样本t检验)。

图1. OSCC患者和健康对照的比较。

A，所有OSCC患者与健康对照的主成分分析，p=0.0001，F=5.9，PERMANOVA。B，OSCC样本与健康对照的Shannon多样性指数，p值不显著，独立样本t检验。C，饮酒对OSCC患者与健康对照组Shannon多样性指数的影响，独立样本t检验。D，唾液流率(SFR)对OSCC患者与健康对照组Shannon多样性指数的影响：Low-<0.5 ml/min，正常-≥0.5 ml/min，独立样本t检验。       在对照组中，饮酒习惯显著影响Shannon多样性指数(独立样本t检验p=0.037)，但在OSCC组中无显著影响。饮酒者唾液中的细菌多样性更高。OSCC组中唾液分泌不足对Shannon多样性的影响接近显著(独立样本t检验p=0.055)，而对照组中差异不显著。唾液分泌不足的OSCC患者多样性较低。 其次，作者从原始数据集中选择了不吸烟、不饮酒的有齿受试者，形成一个称为“无偏数据”的子集。该子集包括24名治疗前OSCC患者和34名健康对照者，他们不吸烟或饮酒并且口腔中至少有一颗牙齿。两组间微生物谱的差异有统计学意义(PERMANOVA，F=2.4，p<0.001)，而Shannon多样性指数无显著差异。 对“有偏”和“无偏”数据进行了LEfSe分析(图2)。在两个数据集中，OSCC组中更丰富的具有显著区分性的zOTUs包括zOTU1 Streptococcus dentisani/infantis/mitis/oralis/oral_taxon_058/oral_taxon_061/oral_taxon_064/oral_taxon_070/oral_taxon_423/oral_taxon_431/tigurinus、zOTU43 Streptococcus anginosus以及zOTU56Abiotrophia defectiva。对照组中更丰富的显著性zOTUs包括zOTU3 Veillonella atypica/dispar、zOTU4 Streptococcus australis/parasanguinis_I/parasanguinis_II/oral_taxon_057/oral_taxon_066和zOTU30 Actinomyces oral_taxon_172。 此外，整体检验法揭示了与OSCC或对照组相关的zOTUs组(见附加文件2)。整体检验法产生了16个具有统计学意义的zOTUs组，其中三组由单个zOTU组成，可显著区分患者与对照组(附加文件3，表1)。13组zOTUs中有9组与OSCC相关(p=0.012，p=0.017，p=0.025，p=0.026，p=0.047，p=0.029，p=0.033，p=0.039和p=0.039)，而3组与对照组相关(p=0.025，p=0.026和p=0.041)。一组zOTUs与OSCC或对照组均无明确关联(p=0.043)。OSCC相关zOTUs组中最丰富的属是链球菌属Streptococcus、梭杆菌属Fusobacterium、二氧化碳噬纤维菌属Capnocytophaga和乳杆菌属Lactobacillus，对照组相关的组中最丰富的属是普雷沃氏菌属Prevotella、放线菌属Actinomyces和巨球形菌属Megasphaera。3个区分性zOTUs具有显著性差异，分别是OSCC相关zOTU211 Streptococcus anginosus (p=0.003)、zOTU239 Catonella morbi/oral_taxon_164(p=0.007)和zOTU1 Streptococcus dentisani/infantis/mitis/oralis/oral_taxon_058/oral_taxon_061/oral_taxon_064/oral_taxon_070/oral_taxon_423/oral_taxon_431/tigurinus(p=0.030)。

为了解决吸烟对唾液微生物组的影响，根据吸烟状况(是/否)进一步划分OSCC组和对照组，并使用整体检验法来揭示与吸烟和非吸烟OSCC患者以及吸烟和非吸烟对照相关的zOTUs组。这一次，整体检验法产生了19个显著的zOTUs组，可将这四组彼此区分开来(附加文件3，表2)。其中5组与OSCC吸烟者组有关(p<0.001)，4组与OSCC非吸烟者相关(p均<0.001)。此外，5组zOTUs与非吸烟对照组显著相关(p均<0.001)，只有一组(由单个zOTU组成)与吸烟对照组相关(p<0.001)。还有四组zOTUs被确定为显著但不与任何特定组相关。吸烟OSCC患者中最常见的属是乳杆菌属和密螺旋体属Treponema，而吸烟对照组中唯一显著的zOTUs是zOTU131 Campylobacter rectus/showae。

图2. 有偏A和无偏B数据集中OSCC患者与健康对照之间区分性zOTUs。*zOTU1 Streptococcus dentisani/infantis/mitis/oralis/sp. oral taxon 058/sp. oral taxon 061/sp. oral taxon 064/sp. oral taxon 070/sp. oral taxon 423/sp. oral taxon 431/tigurinus。zOTU4 Streptococcus australis/parasanguinis I/parasanguinis II/sp. oral taxon 057/sp. oral taxon 066。 

2.癌症治疗前后样本的比较

癌症治疗后获得28例OSCC患者样本，平均随访期为47.8个月(SD 12.1，min 35，max 78，表2)。基线时这28例患者与其他OSCC患者没有显著差异，除了T1肿瘤的患病率较高(Pearson chi-square，p=0.035)。随访期间SFR显著降低，唾液中念珠菌(Candida)浓度高于基线(配对样本t检验p<0.001，相关样本Wilcoxon符号秩检验p=0.028)。 

表2. 分析28例OSCC患者治疗前后的基本特征。

从基线到随访期间微生物谱发生了显著变化(restricted PERMANOVA，F=2.3，p<0.001，图3A)，样本在组成上不太相似(Bray-Curtis距离，Mann-Whitney U检验，p<0.001，图3B)，与基线相比，随访时α多样性较低(配对样本t检验，p=0.008，图3C)。随访时OSCC患者的微生物谱与健康对照组的微生物谱存在显著差异(PERMANOVA，F=6.43，p<0.001)，α多样性显著降低(Shannon多样性指数，独立样本t检验p=0.003)。随访样本的微生物谱受唾液分泌不足(PERMANOVA，F=1.711，p=0.009)、念珠菌感染(PERMANOVA，F=1.983，p=0.024)、局部-区域晚期癌症(III期或IV期，PERMANOVA，F=1.813，p=0.036)和接受辅助放疗(PERMANOVA，F=1.772，p=0.041)的显著影响。

图3. 28例OSCC患者治疗前后的唾液微生物组比较。A，主成分分析，p<0.001，F=2.3，restricted PERMANOVA。B，Bray-Curtis距离，p<0.001，Mann-Whitney检验。C， Shannon多样性指数，p=0.008，配对样本t检验。      

LEfSe分析鉴定出28个具有显著鉴别性的zOTUs，其中14个在FDR校正后仍然显著(图4)。基线样本中显著相关的是zOTU15 Actinomyces odontolyticus/oral_taxon_180、zOTU21 Streptococcus sanguinis、zOTU26Veillonella rogosae、zOTU47 Fusobacterium nucleatum vincentii、zOTU48 Capnocytophaga leadbetterii、zOTU56 Abiotrophia defectiva、zOTU72 Lautropia mirabilis、zOTU76 Solobacterium moorei、zOTU88Porphyromonas endodontalis/oral_taxon_285、zOTU102Mogibacterium diversum/neglectum/pumilum/vescum、zOTU146 Leptotrichia buccalis和zOTU633Streptococcus sp.。随访样本中显著相关的zOTUs是zOTU115 Lactobacillus casei/paracasei/rhamnosus和zOTU163 Actinomyces gerencseriae。

图4. 28例OSCC患者基线和治疗后样本之间的差异zOTUs(LEfSe分析)。*zOTU1 Streptococcus dentisani/infantis/mitis/oralis/sp. oral taxon 058/sp. oral taxon 061/sp. oral taxon 064/sp. oral taxon 070/sp. oral taxon 423/sp. oral taxon 431/tigurinus。      

讨论

本研究旨在探讨OSCC患者的唾液微生物组是否不同于健康个体，以及治疗前到治疗后阶段微生物群的变化。作者研究了99例OSCC患者治疗前和28例治疗后的唾液样本。这些结果与101名健康对照者的结果进行比较。基于这些结果，OSCC似乎可影响唾液微生物谱，即使在去除吸烟、饮酒和无牙齿的辅助因素后差异仍然很明显。然而，癌症对唾液样本的微生物α多样性没有显著影响。 基线时OSCC患者的微生物谱显示，既往与全身感染相关的细菌相对丰度较高，例如S. anginosus、A. defectiva和F. nucleatum，而健康对照者的微生物谱显示，既往与健康相关的细菌丰度较高，例如Prevotella histicola、H. parainfuenzae和F. periodonticum。具体而言，LEfSe分析和整体检验法分析发现，与健康对照组相比，OSCC患者咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)丰度明显更高。在既往研究中报道了S. anginosus在多个器官系统中引起菌血症和相关化脓性感染灶。此外， A. defectiva将基线时OSCC患者与其治疗后样本和健康对照组的样本区分开来，此前该菌曾被认为与感染性心内膜炎和眼内炎有关。 在本研究中，与基线OSCC患者相关的F. nucleatum和C. leadbetteri等物种也与OSCC有关。然而，在本研究的数据中，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)并不是OSCC患者与健康对照者或治疗后样本之间的差异因素。这一结果与早期发现牙龈卟啉单胞菌与OSCC间存在强烈关联的结果相反。 当使用整体检验法分析吸烟对微生物组的影响时，吸烟OSCC患者中最显著的属是乳杆菌属和密螺旋体属。具体而言，与吸烟OSCC患者相关的物种包括几种语龋齿相关的物种，例如加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，以及密螺旋体属物种T. socranskii和T. maltophilum，它们与严重牙周炎和根尖周病变有关。这支持了先前已经证明的吸烟、口腔健康不良与OSCC之间的关联。 经过相对较长时间的随访后，本研究中患者的微生物谱显示出与基线相比，彼此间相似性降低，样本内的多样性降低。此外，与对照组相比，治疗后样本的微生物谱显著不同。随访时的Shannon多样性指数显著低于对照样本。这些结果表明，长远来看，接受治疗的确会影响唾液微生物组。这种改变可能是不利的，因为随访后微生物组倾向于耐酸类群的增加和多样性的减少，这两者都与口腔健康状况不佳有关。 11例患者接受辅助放疗，1例患者接受辅助放化疗。在随访中，接受放疗的患者和未接受放疗的患者之间的微生物谱有轻微但显著的差异。当对随访样本进行念珠菌感染、唾液分泌不足和晚期癌症影响的测试时，这种差异也很明显。由于更高阶段的癌症患者倾向于接受辅助(化疗)放疗，这反过来又与唾液分泌不足和念珠菌病的发展有关，因此放疗引起的差异实际上可能是本研究中发现的其他具有显著影响的因素之一的结果。在本研究中，样本数量太少，无法从这组患者中得出关于放疗效果的有意义的结论。然而，以往的研究已发现放疗对头颈癌患者口腔微生物组产生了深远影响，且致龋类群明显增加。 术后口腔健康问题是OSCC患者的主要主诉之一。因此，在OSCC治疗后努力构建平衡的口腔微生物组应被视为与重建功能和外观同等重要。由于OSCC患者术前和随访时微生物特征都与健康对照组显著不同，因此应鼓励口腔卫生专业人员更多地宣传平衡和稳定口腔微生物组的必要性。然而，应该指出的是，口腔微生物组的积极修饰措施仍然难以捉摸，需要进一步研究。 最后，需要讨论本研究的不足和优点。主要不足是缺乏完整的口腔检查记录，如果完善了咀嚼能力、唾液pH值和饮食分析等数据，对进一步的结论很有价值。特别是缺乏所有参与者的完整牙周记录，可能会导致我们无法纠正的混杂因素，因为牙周疾病预计会影响微生物谱。由于治疗后的随访样本数量少，我们也无法评估不同治疗策略对结果的影响。此外，我们无法通过吸烟、饮酒和无牙齿来匹配对照组。然而，吸烟者的百分比与芬兰赫尔辛基和Uusimaa地区健康人群的人口统计数据相符(2014年芬兰赫尔辛基和Uusimaa地区65岁及以上人口的8.1%)。 这项研究的优势在于研究组在芬兰人口中年龄和高加索种族方面的同质性。OSCC患者基线研究组也相对较大，这使我们能够通过排除吸烟、饮酒和无牙齿受试者形成无偏倚组并通过整体检验法校正协变量来研究微生物谱。这令统计分析结果更为可靠，尽管无法在整体检验法中纠正吸烟，因为它会导致分析中失去癌症的影响。另一个优势是相对较长的随访时间，这使我们能够研究OSCC治疗对唾液微生物组的长期影响。 未来我们建议进一步研究唾液的化学成分及其在整个OSCC治疗过程中的变化，以解释这些变化可能对唾液微生物组产生的影响。    

结论

本研究的假设得到了证实，当比较OSCC患者与健康对照时，唾液中的微生物谱确实不同。同样，正如预期，治疗后样本与治疗前样本的微生物谱存在差异。生态上的不利变化是具有临床意义的发现，如耐酸类群的增加和α多样性的减少，以及基线时OSCC患者潜在致病性分类群的相对丰度较高。基于这些结果，作者认为OSCC患者可以从预防措施中获益，例如推荐使用益生元或益生菌、唾液替代品或膳食咨询。此外，作者建议OSCC患者应该与口腔健康专家建立长期的关系，超过与手术团队的5年随访，以帮助预防癌症治疗后的口腔疾病。以上措施都有望稳定口腔微生物组，但需要进行干预研究才能得出该领域的进一步结论。   

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