区分IgG Fc糖基型的纳米抗体

前言

蛋白质糖基化是生物功能的重要介质，然而，研究复杂的糖基形式具有挑战性，凝集素类工具受到交叉反应的限制，而质谱分析需要对目标蛋白质进行纯化和分离，且时间周期长成本高。本期小编为大家介绍用于IgG Fc糖基特异性的纳米抗体的发现和表征方法。这些纳米抗体能够区分糖基形式，而不与非靶糖蛋白或糖基发生反应。通过将其与分析方法相结合，可以用于IgG糖基谱，对登革病毒进行临床分层，选择性地在体内外干扰IgG与Fcγ受体的结合，以及在活体细胞上研究IgG的糖基结构，为便捷分析IgG Fc糖型提供了新策略。

蛋白质糖基化研究方法

由于交叉反应、亲和力差等原因，大多数用于分析糖基形式的试剂都不够理想。此外，成功靶向糖基表位的抗体通常只对糖基构型具有特异性，但对显示该构型的特定糖蛋白是非特异的。目前，研究蛋白质糖基化最准确的方法是质谱分析结合高效液相色谱，但是成本高周期长。

IgG Fc糖基特异性纳米抗体

研究者选择纳米抗体作为研究IgG Fc糖型的可替代分析方法。使用化学酶法将利妥昔单抗工程化为三种糖基形式：半乳糖化不含核心岩藻糖 (G2)、半乳糖化岩藻糖化 (G2F) 和半乳糖化唾液酸化岩藻糖化 (S2G2F) ，图1A,B。

图1. (A)IgG Fc上Asn-297的N-链接糖基的示意图。

(B)利妥昔单抗（rituximab）的G2和G2F糖基形式。(C)通过MACS和FACS筛选特异性识别G2或S2G2F糖基形式纳米抗体的筛选策略。

通过酵母表面展示技术结合MACS和FACS筛选出具有特异识别IgG Fc G2糖基形式的纳米抗体（C11、D3）图2，和S2G2F糖基形式的纳米抗体（C5、H9），图3。

图2. 识别IgG1 Fc G2糖基形式的两个主要克隆C11和D3的结合动力学。

图3. 识别IgG1 Fc S2G2F的两个主要克隆C5和H9的结合动力学。

亲和力成熟产生nM KD的纳米抗体

特异识别G2糖基形式的C11亲和力较差，因此通过设计CDR的位点饱和突变文库和筛选获得高亲和力突变体B7。

图4. C11的亲和力成熟产生了亲和力在纳摩尔级的纳米抗体。

(A) C11的三个CDR的NNK位点饱和突变的示意图。亲和力成熟文库的高通量测序表明，每个CDR约有1个突变，总共每个克隆约有3个突变。(B) 五个特异于不含核心岩藻糖的高亲和力克隆的CDR序列和与G2和G2F糖基形式的解离常数（KD）。

纳米抗体多聚体具有极高的结合亲和力

研究者将最具特异性的B7构建成四聚体，显示出显著增强的结合亲和力，同时保持了特异性，图5F。并且与可溶性FcγRIIIA相比，B7四聚体表现出更高的特异性。表明了纳米抗体作为针对去除核心岩藻糖的IgG的检测优势。

图5. (F,G)四聚体B7或四聚体FcγRIIIA与rituximab的G2或G2F糖基形式的结合动力学。

(H) Luminex测定比较四聚体B7与四聚体FcγRIIIA检测rituximab的G2或G2F糖基形式的特异性。

为了排除对自由糖基的结合，研究者使用B7检测N-糖基组阵列。结果表明B7仅识别人IgG阳性对照，并不结合任何N-糖基，无论是否有岩藻糖。并验证了B7保留了对所有不含核心岩藻糖的IgG1形式（G0、G2和S2G2）的结合，无论是否有半乳糖化或唾液酸化。综合这些研究表明，用于特异性糖基形式的纳米抗体结合依赖于蛋白质序列和糖基结构的组成。

IgG Fc糖基特异性纳米抗体阻断IgG–FcγR相互作用

Epitope mapping 显示B7和FcγRIIIA对不含核心岩藻糖的IgG1的竞争结合，图6A。B7及其亲和力较高的突变体X0和mC11竞争性抑制IgG与多种FcγR家族成员的结合，图6 B和C。

图6. B7和FcγRIIIA对不含核心岩藻糖的IgG1的竞争结合。

IgG Fc糖基特异性纳米抗体可用于病毒感染的诊断和预后分析

不含核心岩藻糖的IgG1水平是严重登革病毒感染的强有力的预后标志。纳米抗体应用于生化分析，如夹心ELISA或Luminex可以提供快速且低成本的分析方法，与传统的IgG糖基分析方法如质谱形成对比，后者需要纯化的输入材料、昂贵且高度专业的设备，并且耗时更久，图7A。

研究者首先通过免疫沉淀人血清或去除IgG的血清来确认B7不与其他血清糖蛋白结合。基于纳米抗体的不含核心岩藻糖的IgG量化在患者的纯化IgG或血清中均表现出与质谱分析数值的强相关性，图7B和C，而使用纯化的IgG或稀释的血清对分析结果几乎没有影响，图7D。

基于纳米抗体量化登革病毒感染的患者在入院时（症状发作后2-6天）的不含核心岩藻糖的IgG1水平，能够区分几天后发展为登革热(DF)，登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）的患者，图7F。ELISA和Luminex的分析证实了IgG糖基特异性纳米抗体在预测严重登革病发展中的预测价值，图7G。

图7.

 (A)质谱法和基于纳米抗体的IgG Fc糖基分析方法比较。基于纳米抗体的分析在不需要IgG纯化或复杂仪器的情况下3小时内完成。（B和C）Luminex分析量化纯化IgG或患者血清中的不含核心岩藻糖的IgG1水平。（D）在患者纯化IgG或血清中检测到的不含核心岩藻糖的IgG1水平的相关性。（F）登革病患者不同疾病严重程度的不含核心岩藻糖的IgG1水平。（G）预测严重登革病感染入院时不含核心岩藻糖的IgG1水平的受试者工作特征（ROC）分析。

纳米抗体可检测活细胞上的IgG Fc糖基型

常规方法无法对活细胞进行IgG糖基型表征。研究者使用B7对表达IgG1的DB淋巴母细胞系的进行流式分析，结果显示野生型DB细胞的IgG1几乎均为岩藻糖化，而通过CRISPR介导的岩藻糖基转移酶FUT8基因敲除的细胞显示强染色，确认了B7用于检测不含核心岩藻糖的IgG的特异性,图8B。并在外周血中分离的记忆B细胞中FUT8敲除再次确认B7的特异性,图8C。

图8. 纳米抗体B7检测活细胞上的BCR糖基型。

(A) 膜结合型IgG BCR及其相关的糖基的示意图。(B) B7四聚体染色分析DB细胞中IgG的糖型。(C) 用B7四聚体染色分析外周血记忆B细胞的IgG的糖型。

小结

IgG Fc的糖基化差异调节其向细胞传递信号并参与执行重要的抗体效应功能。IgG Fc糖基形式复杂但现有研究工具有明显不足。研究者通过纳米抗体酵母表面展示文库，结合流式分选获得的纳米抗体能够识别不同的IgG糖基型，并可用于活细胞糖基化的研究，也为基于疾病相关的IgG糖组改变对患者风险进行分层的即时诊断工具开发提供了新的思路。

参考文献：

Kao KS, Gupta A, Zong G, Li C, Kerschbaumer I, Borghi S, Achkar JM, Bournazos S, Wang LX, Ravetch JV. Synthetic nanobodies as tools to distinguish IgG Fc glycoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Nov 29;119(48):e2212658119. doi: 10.1073/pnas.2212658119.

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