蛋白质组学技术是开发PROTAC和分子胶药物的高频分析手段

（一）蛋白质组火山图——靶向蛋白降解药物必备分析图

（1）为什么TPD药物研发中离不开蛋白质组火山图？

传统的小分子药物主要的作用模式是通过占据靶点的活性位点来抑制、阻断下游信号通路的转导。因此，传统的小分子药物依赖与靶蛋白特定位点长时间和高强度的结合来发挥作用，这导致小分子结构设计可选择的范围较小，且需要较高的药物浓度才能起效。而以PROTAC和分子胶为代表的靶向蛋白降解（TPD）药物，包括LYTAC、AUTAC、ATTEC、PROTAB等是从根源上降解致病的蛋白。此外，TPD药物分子的结构设计，不局限在与蛋白的活性位点区域结合，其只需与靶蛋白任何部位有一定的结合率，理论上都可以执行降解功能。因此，TPD药物可以使一些传统意义上的不可成药的靶点重新具备成药可能，此外还能在一定程度上改善传统小分子药物的耐药问题。

但是，TPD药物是对蛋白进行“刚性”的降解，一旦发生脱靶、错靶等事件，其导致的毒副作用将会带来严重的生物安全性问题。因此，在TPD药物的临床前开发阶段，对候选药物分子进行靶向特异性验证，探究药物的脱靶、错靶或者多靶情况，是TPD药物开发不可缺少的技术环节。

目前常规的生物分析手段，包括抗体介导的光学检测技术如WB、ELISA，或荧光素酶检测技术如NanoBiT、HIBIT等，都是针对某些特定蛋白进行的分析，不能对细胞内多达数千或者上万个蛋白质进行全局性分析和含量跟踪。因此，目前只能通过蛋白质组学技术对待测样本进行稳定、高效且灵敏的检测，才能在验证TPD药物靶向特异性的同时，探究其潜在脱靶、错靶和多靶等问题。

（2）如何得到一张蛋白质组火山图？

蛋白质组学可以简单概述为实验前处理、质谱采集和数据分析。靶向蛋白降解药物蛋白质组学（TPD组学）通常可以细胞、组织为样本来源进行蛋白质组学检测。对照组一般使用药物溶剂进行处理，药物处理组则根据特定浓度和时间进行药物处理，每组建议至少三个生物学重复。待测样品经过细胞破碎或组织研磨等，分别提取其可溶性总蛋白，然后经过蛋白酶切将总蛋白混合物酶解为肽段混合物，最后通过高分辨质谱对待测物进行采集分析。采集到的原始质谱数据（Raw data）经过蛋白质组搜索引擎的检索，生成包含各个样品的鉴定和定量信息列表。最后通过统计分析就可以得到两组处理间蛋白含量差异的火山图了。

需要注意的是，目前TPD组学的质谱采集方案通常选择非数据依赖采集（DIA）或者标记定量技术（TMT）两种，建议2019年后发布的高端蛋白质组学质谱设备使用DIA方案，发布较早的相对低端质谱系统使用TMT方案。

（3）如何读取蛋白质组火山图中的信息？

火山图分析是转录组、蛋白组和代谢组等组学中常见的可视化方法，也是差异分析的重要手段之一。组学技术检测到的基因、蛋白或化合物往往数据量巨大，以蛋白组学数据为例，一般能检测到成千上万个蛋白。在火山图中，蛋白沿对比组之间的含量变化倍数和统计检验显著度两个维度展开。因此，可以通过选择不同蛋白的差异表达的变量倍数和变化显著性参数，来直观的筛选出差异表达的肽段或蛋白。

3.1火山图中各个元素的含义

①x轴：是log2FoldChange，也就是对Fold Change做以2为底的对数转换。

②y轴：是 -log10P-value，就是对P-value做以10为底的对数转换再取负数。

③Fold Change：是两组样本蛋白表达量的差异倍数。

④P-value：是衡量统计检验中差异显著程度的数值，一般实验使用Student’s t-test来进行两组样本间的统计检验，得到P-value用以评价两组样本间的差异显著度。

⑤火山图中的点：图中的每一个点，代表一个蛋白或一条肽段。

⑥火山图中的分区：一般火山图会用三条参考线将图形分为六个区域。其中和y轴平行的两条参考线从左到右划分的三个区域分别为下调、无显著变化和上调的Fold Change cutoff。和x轴平行的参考线为统计检验显著度P-value的cutoff。

3.2蛋白质组学中火山图的适用范围和注意事项

①火山图一般用于蛋白表达量和修饰肽段的含量的差异分析。

②火山图一般只用于两个组之间的比较。

③为了保证统计检验的可信性，分组内的生物学重复最好至少3个。

④Fold Change 和 P-value 的cutoff需要根据数据类型和研究目的来设置。推荐的参数设置有：

3.3火山图使用案例举例：

采用虚拟的火山图进行数据展示，当特定细胞系经过DrugA药物处理后，处理组（DrugA）与对照组（DMSO）通过挖掘蛋白质组学数据发现特定蛋白含量发生显著变化。

该图以处理组和对照组的蛋白表达量的比值（即Fold Change）取2为底的对数转换为横坐标，以两组间的统计检验显著度P-value进行以10为底的对数转换后取负数为纵坐标。图中的每个点代表一个蛋白，图中的三条虚线为参考线，横向的一条虚线为P-value的Cutoff，纵向两条虚线为Fold Change的Cutoff。如图所示，药物处理组相较于对照组有2个蛋白表达量显著下降（位于图的左上角区域），1个蛋白的表达量显著上升（位于图的右上角区域）。

以2023年发表在Nature biotechnology 的论文 A proteome-wide atlas of drug mechanism of action 一文中的某张火山图为例。

作者通过JP1302药物处理FACT复合体，探究该药物与复合体及接头组蛋白介导的核小体组装相关性。如图所示，研究人员比较了JP1302组和DMSO组分别处理4小时后细胞中的蛋白变化情况，筛选到了药物处理引发下调的H1接头蛋白，证明了药物的有效性以及为后续的机制推导提供了实验证据。

值得注意的是，火山图已经应用广泛应用到TPD药物研发中。如图所示， Arvinas 公司在2021年，在 AACR ANNUAL MEETING 展示的火山图数据中，该图采用了另一种绘制方式，即交换了横、纵坐标轴。图片展示了VCaP细胞系中药物处理组（10 nm ARV-110, 8 hours）和对照组近4000个蛋白的表达量变化，结果表明蛋白靶向降解剂ARV-110能够特异性降解靶点AR，且在短时间处理过程中，没有观察到明显的脱靶现象。

另外，2020年发表在Cell的论文Mapping the Degradable Kinome Provides a Resource for Expedited Degrader Development，火山图应用到TPD药物研发的早期，主要用于TPD靶向药物的筛选阶段。

火山图也大量用于靶向蛋白降解药物的药物特异性评价中，如在2022年发表于Nature的Antibody targeting of E3 ubiquitin ligases for receptor degradation。

总之，火山图已经广泛应用于TPD药物基础研究和新药研发中，主要用于探究药物的靶向特异性、潜在脱靶等，成为了TPD药物结果分析不可缺少的数据展示结果。结果稳定、可靠的火山图需要具备以下要求：①根据TPD药物的降解特点，设计合理的处理时间、给药浓度条件；②采用标准、稳定的工业化步骤进行蛋白质组学样品前处理；③采用高端质谱仪器，搭配最佳的采集模式进行样本检测；④根据TPD药物项目特点及原始数据，设计特定的分析参数进行数据分析，绘制图像；⑤有效分析、解读数据结果，并结合不同TPD药物特点及相关的生物学实验结果等，为药物开发提供有效的证据、结论。

嘉华药锐已经为全国数十家TPD药物研发企业提供了蛋白质组分析服务，产生的数据已被用于IND申报，并通过审批。嘉华药锐已经在靶向蛋白降解药物的蛋白质组学分析方面积累了丰富的经验，相关应用论文将在后面的短文中陆续介绍。