细胞外囊泡负荷

细胞外囊泡负荷

作为药物递送载体，EV可以装载治疗药物，包括核酸和化疗药物。由于其低免疫原性和良好的生物相容性，它们是携带外源性药物的有前途的递送剂。载药方法大致可分为分离前载药（预载样）和分离后载药（后上样）。使用孵育、超声和转染等不同方法加载的EV的表征、加载速率和功能。

1、预加载

简而言之，“预装载”方法涉及在EV隔离之前装载货物，通常具有有用的治疗效果。EV研究刚开始时，EV的载药效率和封装方法引起了广泛关注。在细胞生长过程中，细胞继续通过EV相互通信。在这个阶段，药物可以被细胞使用这些囊泡吸收和分泌。结果，药物被加载到囊泡中。最常见的预加载方法是孵育、感染和超声结合微泡（USMB）。

在通过孵育上样药物的各种策略中，直接孵育是最简单的方法。制造了一种名为sEV-CUR的新药物输送系统。在该系统中，姜黄素（CUR）与脂肪衍生的间充质干细胞（ADMSCs）一起孵育，并使用UC收获sEV-CUR颗粒。孵化后，EV的平均直径和zeta电位基本保持一致，加载效率分别为82.26%±5.25%。值得注意的是，sEV-CUR表现出优异的治疗功能（抗氧化应激和抗细胞凋亡能力）、良好的生物利用度、控释和更高的稳定性。众所周知，EV由于其磷脂双层组成而具有疏水和亲水性。因此，开发了一种称为ICG/PTX-EVs的药物输送系统。为此，培养人胚胎肾293T（HEK293T）细胞以获得EVs，然后将其与紫杉醇（PTX）和ICG（ICG/PTX重量比为2/1）混合。ICG因其亲水性而被掺入EV中，而PTX由于其疏水性而被掺入EV的磷脂双层中。EV的平均尺寸和zeta电位的绝对值在ICG和PTX孵化后略有增加。此外，ICG和PTX的封装效率分别为≈60.7%和51.9%≈。作为递送载体，EV还表现出良好的包封效率、细胞内化、肿瘤部位积累、光稳定性和储存稳定性。

使用转染方法，将各种药物转染到细胞中，并专注于中性粒细胞样分化人早幼粒细胞白血病（dHL-60）细胞中EV的负载能力。与HL-60衍生的EV和中性粒细胞衍生的细胞外囊泡（NDEVs）相比，dHL-60细胞来源的EVs具有更高的效应功能（量更大、效率更高），EV的生产效率更高、免疫原性更低。这表明中性粒细胞和中性粒细胞样早幼粒细胞可以作为EVs载药的平台。开发了一种MSC衍生的外泌体（MSC-EXO）载体，通过转染递送卡巴他赛/肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体（CTX/TRAIL）组合，并取得了优异的抗肿瘤活性。MSCTs-EXO/CTX的粒径约为60-150nm。包压效率和载药量分别为93.7±1.53%和15.43±0.44%。MSCTs-EXO-CTX显示出TRAIL和CTX的协同作用。此外，源自脂肪来源干细胞（ADSC）的工程外泌体也被用于包封NT-3 mRNA，并通过感染促进周围神经再生。

USMB已被证明可以触发癌细胞释放EV。使用这种方法生成了含药物的EV。将荧光染料细胞追踪绿（CTG）或牛血清白蛋白与异硫氰酸荧光素（BSA FITC）结合，使用不同的超声声压加载到人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中。在0.6 MPa时，HUVEC中的BSA-FITC信号强度最高（与不处理和0.7和0.8 MPa的不治疗相比）。USMB诱导的BSA-FITC信号强度高于未处理组。搭载BSA-FITC的HUVEC也发布了含有BSA-FITC的EV。简而言之，结果表明，USMB可用于生产含有毒品货物的电EV。然而，USMB不适用于摄取后容易淬灭并被困在内体-溶酶体降解途径中的物质。

在预加载方法中，孵育是最简单的。但是，它很耗时，而且效率低。感染是将RNA、药物和无机材料等外源性货物添加到EV中的最佳选择，但它与运营挑战和高成本有关。USMB是生产含有货物的EV的好方法，但其缺点之一是容易被困在细胞器内。

2、后加载

分离后的药物负荷被认为是后负荷。预加载中使用的加载方法也可用于后加载应用。

对于加载后孵育策略，从M1巨噬细胞中分离出EV，并用透明质酸（HA）和/或β阻滞剂卡维地洛（CV）孵育它们。这些EV被称为MM-EV（调制M1 EV）。MM1-EV在与DOX孵育后进一步加载（MM1-DOX）。具有HA和CA的MM1-EV可促进巨噬细胞极化至M1表型并改善细胞摄取，从而增强DOX的抗肿瘤作用。同样，人单核细胞（THP-1）接受佛波12-mrustate 13-乙酸酯（PMA）处理，并在刺激期间释放外泌体A15（A15-Exo）。A15-Exo与DOX一起孵育过夜以获得A15-Exo/DOX。之后，使用A15-Exo/DOX与胆固醇修饰的mi159（CHO-miR159）共孵育，以获得称为Co-A15-Exo的最终递送系统。使用EV装载DOX和氯硝胺（LND）。通过简单输注后施加不同的离心力制备了两种不同尺寸的EV（16k EV和120k EV）。16k-EV和120k-EV的平均尺寸和zeta电位分别为93.2±24.2nm和-15.2mV和70±11.1nm和-15.9mV。DOX和LND在16k-EV中的封装效率分别为0.81±0.22%和4.16±1.9%，而120k-EV的封装效率分别为0.43±0.03%和2.77±0.35%。值得注意的是，负载DOX和LND的EV表现出优异的抗癌活性，而较小的EV对细胞内DNA合成的抑制、细胞内ATP的抑制和促进细胞内ROS的产生。

使用来自巨噬细胞的EV基于超声方法靶向三阴性乳腺癌（TNBC）。EV在孵育（DOX）或超声处理（PTX）后用作PTX和DOX的药物递送载体。得到的EVs-DOX和EVs-PTX呈球形，尺寸分布均匀。值得注意的是，EVs-DOX和EVs-PTX表现出优异的细胞内积累、癌细胞中的药物积累、低免疫原性和高稳定性。

电穿孔是将药物装入EV的另一种有效方法。在电脉冲之后，EVs膜内产生孔隙，允许微分子进入EV。使用电穿孔将DOX加载到源自晶状体上皮细胞（LECs）的外泌体中，由于外泌体的同源靶向，有效地防止了后囊混浊。此外，由介孔二氧化硅和铁组成的磁性纳米颗粒（MNPs）3O4也被开发。MNP加载铁死亡补偿剂抑制剂，并使用抗CD63抗体进行修饰。因此，它们可以特异性地结合来自人类MSC的CD63过表达外泌体。血管肽-2被掺入外泌体膜中，允许外泌体穿过BBB并进入胶质母细胞瘤细胞。外泌体通过电穿孔加载了针对铁死亡补偿剂GPX4的小干扰RNA。设计了MSC衍生的sEV在其表面表达FGL1/PD-L1，将其与FK506混合，用PBS稀释，然后放入电穿孔杯中。然后，他们使用300V和150μF的电穿孔设备对EV进行电穿孔。该步骤之后在冰上孵育30分钟以恢复膜孔，最后将混合物离心以获得样品。

为了采用挤出方法，开发了一种4T1细胞衍生的外泌体伪装多孔二氧化硅纳米颗粒（E-MSN），将ICG和DOX加载到E-MSN中以形成ID@E-MSN。外泌体包被可有效增强ID@E-MSNs的细胞摄取，促进体内长期滞留，并通过外泌体的高纯度提高生物相容性。在其他研究中，也报道了超声和挤出的组合。开发了一种自取向纳米载体（PR-EXO/PP@Cur），以增强药物在作用位点的积累。这种纳米载体是通过超声振荡将PR-EXO（RVG29肽和穿透蛋白修饰外泌体）溶液与PP@Cur（PPS-PEG@Cur胶束）混合，然后通过微型挤出机挤出而开发的。来自4T1细胞的外泌体也用于模拟Fe3O4磁性纳米粒子并同时加载DOX。铁3O4@Exo NPs表现出显著的生物相容性、可控的药物释放和协同光热化疗作用。

在一些表面处理方法中，皂苷、Triton和DMSO等物质被用来修饰EV的表面膜，并通过孔隙形成增加其渗透性。开发了一种货物消除策略，以消除肿瘤衍生的sEV中的原始含量。皂苷处理可以有效地去除GBM-sEV中的原始货物（如蛋白质和RNA）。这些经过治疗的sEV不会促进肿瘤生长。此外，他们比较了三种方法（皂苷、超声和冻融），发现皂苷处理和超声处理提供了最高的蛋白质和RNA去除效率，而通过冻融循环实现的去除效率要低得多。此外，他们成功地实现了同步货物消除和药物装载。在DMSO/PBS中将ICG和PTX与EV混合[4%（v/v）]，并将混合物在2°C下在黑暗中孵育4小时，以实现成功加载。使用相同的方法成功地将ICG和叶酸（FA）加载到外泌体中。

一些设备，如微流体和声流体设备，也可用于后加载。微流控装置通过调节流速和微通道类型，可有效提高DOX对U251-GM衍生外泌体的上样效率从7.86%提高到31.98%。据此制备的负载DOX的GMB衍生外泌体显示出归巢效应。在DOX加载过程中，皂苷被用作透化剂来改变细胞膜的性质，与微通道中的剪切应力诱导刺激协同发挥综合作用。将多孔二氧化硅纳米颗粒、外泌体、药物、液滴旋转、表面声波和叉指换能器组合而成的声流体装置可以将药物装载和外泌体封装简化为一步法，提高药物加载效率。最终产物由药物、多孔二氧化硅纳米颗粒和由内而外的外泌体膜组成，并且装置衍生的外泌体包封可以在细胞摄入实验中显着增强体外的内吞作用。此外，该装置可以将不同形态的含药物纳米颗粒封装到外泌体中。

在后加载策略中，孵育和超声处理方法与预加载策略中使用的方法相似。电穿孔是一种快速加载方法，通过在膜上产生物理孔来起作用。但是，它会破坏膜的完整性和柔韧性。挤出是一种方便的选择，但它提供的封装不足。基于设备的方法需要先进的设施，并且并非普遍可行。

综上所述，各种货物装载方式可分为装前和装后策略。EV负载具有协同效应、高负载和封装效率、良好的稳定性和功能传递等多重优势。但是，不同的方法以不同的方式影响来自同一来源的EV。一般来说，预加载方法（孵育）更容易，但更耗时。超声、电穿孔和挤出等外部干预可提高装载效率，同时导致稳定性下降。皂苷介导的货物消除策略很好地提醒人们，在装载新物质之前，应消除EV的原始内容。值得注意的是，上述两种先进设备为EV与其他代理（例如DOX）的融合提供了有用的工具，因为它们具有突出的特性，包括操作简单，条件可调，快速封装和高负载效率。

 （ANEXT安龄生物科技研发中心）

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