NY-ESO-1 TCR-T临床：实验模型设计和方法细节

这里是关于NY-ESO-1 TCR-T（TAEST16001）细胞治疗产品的I期临床试验的更多研究设计与实验方法细节，由香雪生命科学研发，其I期剂量递增和拓展性研究由中山大学肿瘤防治中心和北京肿瘤医院合作完成，可供对TCR-T感兴趣的研究者学习，详细研究结果见【I期临床：HLA-A∗02:01 NY-ESO-1 TCR-T (TAEST16001)细胞治疗晚期软组织肉瘤患者】。

人T细胞对肿瘤抗原的免疫应答依赖于T细胞表面TCR和HLA复合体的识别。体内大多数T细胞的TCR由α和β两条链组成，其谱系选择发生在胚胎的胸腺中。具有高亲和力TCR的T细胞克隆具有对自体细胞产生免疫应答的潜力，但在体内清除(阴性选择)，仅保留具有低亲和力TCR的T细胞克隆(正选择)。因此，在正常生理条件下，TCRs与抗原多肽-HLA复合体的结合以低亲和力形式发生，一旦发现机体内有外来病原微生物入侵或正常细胞(成瘤)或蛋白质(抗原)异常表达，人体为了保护自身，免受外来病原微生物或体内突变/蛋白质的异常表达，肿瘤细胞吞噬，利用细胞内蛋白质消化系统将细胞吞噬成多肽，然后呈递给T细胞，幼稚的T细胞经过抗原识别、增殖分化后，清除外来病原微生物感染的细胞，维持正常机体。另一方面，TCR对肿瘤相关抗原的亲和力没有T细胞高，TCR胸腺克隆被选在亲和力范围内。虽然T细胞可以低亲和力与肿瘤细胞结合，但由于T细胞下调细胞表面人淋巴细胞抗原的表达，大多数肿瘤可以逃脱T细胞的杀伤。因此，为了有效地清除肿瘤，有必要提高T细胞对抗原的亲和力和与肿瘤细胞的结合能力。

研发高亲和力TCR技术。蛋白质组学分析发现肿瘤抗原肽，生化合成HLA多肽四聚体(pHLA)。用这些pHLA抗原多肽四聚体鉴定T细胞的TCR蛋白。用流式细胞仪分选四聚体染色的T细胞，克隆TCR基因。经快速体外筛选验证后，用分子生物学方法诱导突变，用噬菌体展示技术获得正常表达的TCRs。使用Biacore等分子相互作用精确确定亲和力，然后在细胞生物学水平上证实所得到的TCR是抗原特异性的高亲和力TCR。当这种TCR基因在T细胞表面表达时，它可以在不损害正常细胞的情况下杀死肿瘤细胞。最后，通过动物肿瘤模型验证抗原特异性高亲和力TCR-T对肿瘤生长的抑制作用。在获得高亲和力和非特异性TCR基因后，使用慢病毒作为载体，将识别肿瘤相关抗原NY-ESO-1的高亲和力TCR基因转移到患者自身的T细胞中，并将其回输给患者，以治愈肿瘤患者或终生效果。

T细胞毒性T淋巴细胞是体内主要的抗CD8细胞毒性T细胞(CTL)，CTL主要是通过识别由HLA I类分子呈递的抗原来杀死细胞内寄生病原体、宿主细胞和肿瘤细胞等，这一过程需要CD4+T辅助细胞的帮助。CD4+T细胞还含有一部分CTL，可识别由HLA II类分子呈递的抗原。CTL杀伤靶细胞免疫突触是通过TCR识别抗原多肽-HLA复合体和一些黏附分子(LFA-1和CD2等)而形成的。并分泌细胞因子、穿孔素和颗粒酶，穿孔素单体可穿透靶细胞膜，借助钙离子可形成约16nm的通道，使水、裂解液进入靶细胞，导致其溶解，而颗粒酶也可与靶细胞一起进入靶孔，通过激活靶细胞的凋亡相关酶系统而死亡。CTL可以通过分泌TNF，TNF和表达细胞膜FasL来杀伤靶细胞；这些分子可以与肿瘤细胞表面的TNF受体和Fas结合，激活Caspase信号通路，介导肿瘤细胞的凋亡。在杀死肿瘤细胞后，CTL细胞可以继续寻找具有相同特异性肿瘤抗原表达的肿瘤细胞，并以上述方式攻击肿瘤细胞。一个T细胞可以连续杀死数千个肿瘤细胞。

实验模型和患者细节

研究设计

这是一项开放标签的单臂1期研究，采用传统的3+3剂量递增/拓展设计。计划4个剂量水平：剂量1，5×10^8±30%；剂量2，2×10^9±30%；剂量3，5×10^9±30%；剂量4，1.2×10^10±30%。起始剂量是基于先前研究，输注TCR-T细胞的数量在3.5×10^8到2.9×10^10之间。每个剂量组至少招募3名患者，在剂量增加前28天的观察期内没有观察到剂量限制毒性(DLT)效应。如果记录了DLT，则另外3名患者被招募到发生DLT的组中。不允许患者内剂量递增。MTD被定义为6名患者中有1名或更少患者在细胞输注后发生DLT的最高剂量。

审判监督

这项研究由中山大学肿瘤中心机构审查委员会批准，根据《赫尔辛基宣言》的原则进行，并在ClinicalTrials.gov(NCT04318964)注册。所有患者在入组前都提供了书面知情同意书。

入组资格

符合以下条件的患者：年龄在18岁至70岁之间；具有HLA-A∗02:01等位基因和≥20%的肿瘤细胞通过免疫组织化学表达NY-ESO-1肿瘤抗原；有组织学证实的不可切除、转移或对标准治疗无效的晚期软组织肉瘤；有至少1种通过计算机断层扫描(CT)或磁共振扫描(MR)扫描可测量的疾病(根据实体肿瘤的反应评估标准[RECISTV1.1])；ECOG表现状态评分为0或1；预期寿命至少为3个月；左心室射血分数为≥50%；有足够的肝、肾和骨髓功能。

主要排除标准包括：细胞输注后4周内接受抗癌治疗；NY-ESO-1靶向治疗的病史；细胞输注后4周内伴随的皮质类固醇或免疫调节药物；脑转移或活动性感染或其他不受控制的重大内科或精神疾病病史；以及自身免疫性疾病病史。

治疗

在TAEST16001细胞成功制造并达到质量控制后，从细胞输注前的-7天开始，患者接受改良的淋巴净化方案，氟达拉滨20mg/m2/d，环磷酰胺15mg/kg/d，连续3天。在第1天，全剂量TAEST16001细胞静脉注射超过30min，1次(剂量1或2)或2次连续2天(剂量3或4)。IL-2在第一次细胞输注后30min内皮下注射，每次剂量500000 IU，每日2次，连续14天。

临床评估

研究期间，在预先确定的访问期间采集外周血样进行安全性、药代动力学和药效学分析。安全性通过不良事件监测进行评估，根据NCI不良事件通用术语标准v5.0进行分级。根据ASTCT 2018指南对细胞因子释放综合征(CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)进行分级。DLT被定义为在TAEST16001细胞输注后28天内发生的不良事件，判断可能与细胞输注有关。非血液性DLT是指持续7天或更长时间的3级毒性或4级毒性，与持续时间无关，但研究方案中详细说明的例外情况除外。血液学DLT为4级毒性(淋巴细胞减少除外)，如果不是由于潜在疾病，持续时间超过28天。持续7天以上的3级CRS或4级CRS也被认为是DLT。药代动力学和药效学分析的相关参数由药明康德免疫中心提供。

在TAEST16001细胞输注后的第28天、第60天、第90天、第180天和第270天进行CT或MR扫描以评估肿瘤。肿瘤反应采用RECIST v1.1评价。被RECIST v1.1评估为进展性疾病(PD)的患者可以根据实体瘤免疫反应评估标准(iRECIST)重新评估为免疫未确认PD(iUPD)，并在4-6周后重新评估，直到免疫确认进展性疾病(iCPD)或开始其他抗肿瘤治疗(以先发生者为准)。

主要目的是研究TAEST16001细胞的安全性、耐受性和DLT，以确定MTD。安全性终点包括不良事件、严重不良事件、特别关注的不良事件(CRS和ICANS)、实验室检查、体检评估、心电图和生命体征测量。

次要目的是药代动力学、药效学、客观应答率(ORR，达到RECIST 1.1确认完全缓解或部分缓解的患者比例)、疾病控制率(DCR，达到客观缓解或疾病稳定的患者比例)和PFS(患者入组到细胞输注后疾病进展或死亡之间的天数)。药代动力学分析采用流式细胞仪和qPCR分别检测TAEST16001细胞和每μg基因组DNA(gDNA)的TCR基因拷贝数，计算TCR-T细胞在外周血中的最大值(Cmax)和达到峰值浓度的时间(Tmax)。药效学分析检测外周血中T细胞亚群和抗原特异性细胞毒T淋巴细胞。

还评估了反应与选定的预先指定的生物标志物的相关性：每μg gDNA的TCR基因拷贝数、炎症细胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)和铁蛋白)。

实验方法细节

NY-ESO-1表达

NY-ESO-1抗原在中山大学肿瘤研究中心用免疫组织化学方法检测。使用针对NY-ESO-1的一抗在福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片的3∼5 mm厚切片上进行免疫组织化学染色（IHC）。然后，切片用DAB可视化，并按照制造商的说明用苏木精复染。在研究中，超过20%的IHC表达NY-ESO-1肿瘤抗原的肿瘤细胞被定义为NY-ESO-1阳性表达。

TCR全长序列

慢病毒载体克隆的NY-ESO-1 TCR基因结构图

TAEST16001细胞的产生

患者在入组时接受白细胞分离以采集外周血单核细胞(PBMC)。高亲和力NY-ESO-1特异性TCR-T细胞(TAEST16001细胞)由香雪生命科学生产，用Sepax C-pro和CliniMACSplus从CD14-和CD25耗尽的PBMC中扩增。用αCD3/αCD28抗体偶联的微球激活和扩增CD14和CD25阴性细胞，重组IL-2的浓度为200 IU/mL，慢病毒以每细胞1个转导单位的多次感染进行转导。细胞经Wave生物反应器扩增9-13天，由Sefia收获，Sepax C-pro配制。TCR-T细胞产品将被冷冻以进行放行测试，这需要额外的7-10天。到目前为止，制造过程运行良好，没有发生制造故障。

TAEST16001细胞扩增和持续性的qPCR分析

药明康德免疫中心采用qPCR定量慢病毒骨架的WPRE区，测定每μg gDNA的TCR基因拷贝数。分别于基线和输注后采集外周血样6mL。用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)提取外周血PBMC基因组DNA。用系列稀释质粒制备高、中、低对照的标准曲线。采用Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR系统(ThermoFisher)分别用所设计的引物、探针和FastStart通用探针预混液扩增5μL gDNA和标准品。对于每个样本，每μg gDNA的TCR基因拷贝数一式三份测定。该方法的检测下限为每μg gDNA 20个拷贝。

使用TaqMan Real-time PCR发现RCL

用TaqMan qPCR测定RCL。用系列稀释质粒制备高、中、低对照的标准曲线。用QIAamp DNA血液试剂盒从∼2mL全血中提取gDNA。采用Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR系统分别用所设计的引物、探针和FastStart通用探针预混液扩增5μL gDNA和标准品。

细胞因子测定

用人血清检测人细胞因子/趋化因子/促炎性细胞因子。用MSD V-PLEX Plus定制人生物标志物试剂盒检测IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ。在MESO SECTOR S600对MSD板进行分析。该测定是按照制造商的说明进行的。所有标准品、对照和样品均测量一式两份。

流式细胞术

用肝素真空管采集全血，用红细胞裂解缓冲液处理去除红细胞。对外周血进行多参数免疫表型分型，每个条件下使用大约1.0×10^6个总细胞，并在PK分析中使用同型染色。用厂家推荐的抗体和试剂浓度在室温下将细胞在染色缓冲液中染色45min。PK样本分别用A2P1B、anti-CD45、CD3、CD4和CD8抗体染色，PD样本用A2P1B、anti-CD45、CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RO抗体染色进行Tet+T细胞亚群分析，A2P1B、anti-CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CXCR3、CXCR6、TIM-3、PD-1、CTLA-4和LAG-3抗体分别染色，用Fix/Perm缓冲液渗透30min，anti-Foxp3抗体染色进行Treg分析。然后洗涤细胞，再悬浮在染色缓冲液中，使用配备355 nm、405 nm、488 nm、561 nm和633 nm激光的BD Fortessa细胞仪获取细胞。流式细胞仪文件以.fcs文件格式输出，并使用FlowJo软件进行分析。

多肽和四聚体

GenScrip合成多肽(纯度＞95%)，并用质谱学方法进行了验证。MHC四聚体是内部生产的。

IFN-γ ELISpot测定

用人IFN-γELISpot Set(BD Biosciences)测定IFN-γ ELISpot。人PBMC用于检测效应细胞活性。用单抗包被的96孔ELISpot板进行IFN-γ的ELISpot检测。该测定按照制造商的说明进行。用无菌DPBS(0.2mL/孔)洗涤4次后，用含10% FBS的RPMI-1640培养液(0.2mL/孔)在室温下封闭至少30min。将100 μL多肽池加入板中。加入相同体积的细胞后，在37℃、5%CO2条件下孵育16h不移动。用PBS 0.2mL/孔冲洗5次。稀释后的检测抗体(R4-6A2-生物素)以0.1mL/孔的体积加入，室温下作用2h。用DPBS清洗平板5次后，加入稀释的链霉亲和素-ALP 0.1mL/孔作用1h，用PBS清洗5次，然后加入底物溶液(BCIP/NBT-plus)0.1mL/孔。通过在自来水中充分洗涤，显影直到出现明显的斑点并阻止颜色显影。平板干燥后，用AID ELISpot 7.0软件读取平板，并对结果进行分析。

病毒转导的SL3-A10B0 TCR-T(TEAST16001)的功能鉴定

(A)：利用第三代慢病毒将SL3-A10B0 TCR基因导入CD3/CD28磁珠激活的PBL细胞。用抗TCRVβ8抗体和四聚体(Tetramer)进行流式细胞术检测细胞的转导率。(B)：TEAST16001细胞与阳性靶细胞A375、MEL624(HLA-A*0201+/NY-ESO1+)和阴性靶细胞MEL526、NCI-H1650(HLA-A*0201+/NY-ESO1-)共同孵育，ELISpot法检测IFN-γ的释放。GFP转导细胞和A6 TCR(非HLA-A*0201+/NY-ESO-1+特异性)转导细胞作为阴性对照。(C)优化前TEAST16001和野生型SL3A0B0转导T细胞的细胞毒性比较。细胞毒试验利用IncuCyte平台通过实时成像检测依赖于caspase 3/7的细胞凋亡。

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