关注|细胞培养过程中如何进行细胞质量控制?

就像人有喜怒哀乐一样，细胞也有。细胞的活力和状态是不断变化的，而不是一成不变的。在体外细胞培养过程中，离开机体保护的细胞是非常脆弱的，在不熟悉的生长环境中，即使培养条件的微小变化也可能对细胞产生不可预测的影响。在原代细胞培养过程中，即使培养条件完全一致，细胞的存活质量也会在传代过程中逐渐下降。

以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为例，HUVEC细胞是研究内皮细胞功能的经典体外细胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究其衍生的细胞因子引起的内皮细胞功能改变或损伤对血压的影响;在肿瘤研究中，主要用于实体瘤血管生成的研究。但在传代培养过程中，HUVEC的活力逐渐下降，因此细胞传代最多不超过10代。

新鲜的HUVEC

衰老的HUVEC

传统的细胞培养主要通过显微镜下的形态变化和传代周期的变化来判断细胞的生长和存活状况。这种主观判断无法量化或统计分析。因此，目前还没有准确客观的统一标准来判断细胞存活质量，体外培养细胞存活的质量控制往往被研究人员“忽视”，导致实验结果不稳定。

有效细胞体外培养的新概念——“细胞质量控制”。通过细胞活力、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、DNA损伤五个方面对细胞生长和存活状态进行全面监测。

在这五个方面中，影响最大的是细胞活力。我们来具体谈谈如何确定细胞活力。在体外细胞培养过程中，总会有一些细胞由于各种原因而死亡，通常将活细胞占总细胞的百分比称为细胞存活率。“细胞质量控制”中最基本的指标是细胞活力。常用的流式细胞仪和部分细胞计数仪器可以进行细胞绝对计数，提供准确客观的细胞活力数据，为“细胞质量控制”提供准确客观的统计依据。细胞活力评估并不困难!

满足以下两个条件就可以进行细胞活力检测

1. 正常细胞的细胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一种核酸染料，常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测和流式细胞仪分析。PI不能通过正常完整的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色，可以用来分辨坏死细胞/正常细胞。

2. 加入另一种可以透过细胞膜的核酸染料，就可以通过两种染料将活细胞和死细胞区分开。

PI通常与荧光探针(如Calcein-AM或FDA)结合使用，对活细胞和死细胞进行染色。PI-DNA复合物的激发波长为535 nm，发射波长为615 nm。

细胞活力的技术标准界定

应用案例：纳米药物毒性测试

纳米药物的研究是近年来新药研发的热点。纳米药物载体筛选的首要标准是检测其对细胞的毒性。而在细胞毒性测试中，首先要排除的是基底培养过程中产生的死细胞，即“噪音信号”。在对新型纳米药物载体SEONLA的研究中，Zaloga等人认为只有活细胞比例超过90%方可进行细胞毒性研究，细胞质控的重要性由此可见一斑。

细胞毒性的初级指标是细胞活力。要确定一种物质(如化合物、小分子药物或蛋白质)对细胞的毒性，首先要观察它是否引起细胞死亡，即细胞活力的变化。以维生素C为例，研究发现高浓度维生素C对眼癌细胞系Y79视网膜母细胞瘤细胞有杀伤作用。在这篇文章中，作者使用了一种常用的眼癌化疗药物美法兰作为对照，来测试治疗细胞的活性。结果发现，随着浓度的增加，维生素C对Y79视网膜细胞瘤细胞的杀伤作用逐渐增强，且维生素C对眼癌细胞的杀伤作用优于美法兰。本实验结果为提出更安全有效的眼癌治疗方案提供了理论依据。

细胞质控仪测的数据

除了细胞毒性研究外，细胞质量控制在病毒感染或RNA转染的研究中也非常重要。在这类研究中，转染/感染试剂对细胞具有一定程度的杀伤作用。因此，转染前需要达到一定比例的活细胞，以保证转染后有足够数量的细胞进行后续研究。这个比例需要通过探索实验条件来确定。

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