杨志云教授：中西医协同增强“抗肿瘤第一道防线”-NK细胞作用的临床实践与研究

前言

2023年8月19日，北京中西医结合学会肝病专业委员会2023年学术年会在京成功举办。首都医科大学附属北京地坛医院中西医结合中心杨志云教授在会上作“中西医协同增强‘抗肿瘤第一道防线’-NK细胞作用的临床实践与研究”学术分享，肝胆相照平台将精彩内容整理成文，以飨读者。

肝癌是我国发病率、致死率高的重大疾病。《2020年全球癌症报告》显示，中国是肝癌高发地区，新发病例41.0万例，死亡病例39.1万例，分别占全球45.3%和47.1%。肿瘤的免疫微环境影响肿瘤的进展和预后，NK细胞作为抗肿瘤的第一道防线，仅占外周血淋巴细胞的8％-20％，但其反应速度快，无需抗原预先致敏，即可杀伤肿瘤细胞，在抗肿瘤中发挥着至关重要的作用。

随着肿瘤及慢性病毒感染的持续刺激，NK细胞会逐渐成为一种功能失调的状态，即NK细胞耗竭，表现为受体失衡、功能下降及代谢改变。免疫细胞的能量代谢问题是现在研究的热点问题，已报道在肺癌、乳腺癌、卵巢癌中存在NK细胞糖代谢改变，肿瘤细胞与NK细胞竞争葡萄糖，抑制NK细胞糖酵解和氧化磷酸化能力，导致NK细胞糖代谢下降，无法提供ATP，进而影响NK细胞功能耗竭。

NK细胞免疫检查点治疗肿瘤的临床试验正在进行中，ICI联合治疗（两个免疫检查点联合，或者联合TKI/VEGF单抗）相比单独ICI治疗能够提高一倍ORR，延长中位生存时间，但是会引起一些不良反应如肝功能异常、骨骼损伤、肾功能损伤等等，临床应用存在局限性。

《原发性肝癌诊疗指南（2022年版）》中推荐中医中药治疗，指南指出，中医中药治疗能够改善原发性肝癌患者的临床症状，提高机体抵抗力，减轻放射治疗、化疗以及免疫治疗等治疗手段的不良反应，延长术后无复发生存期，降低术后复发率，提高患者的生活质量和总生存率。这为中医中药研究提供强有力的支撑。

基于临床思考及指南推荐，北京地坛医院中西医结合中心在王融冰教授和王宪波教授的带领下，总结出原发性肝癌的核心证型为气阴两虚、瘀毒内蕴证，核心法则为养阴扶正调肝肾，解毒散结畅三焦，凝练出治疗原发性肝癌的核心方药为养阴扶正解毒方，并针对临床实践，对其做了全方位研究。

图：养阴扶正解毒方

一、肝癌外周血NK细胞计数可预测肝癌患者5年生存率

对北京地坛医院入院治疗肝癌患者进行筛选，纳入具有完整外周血NK细胞临床资料者179例，分别进行回顾性5年结局事件队列研究（n=121例）和前瞻性1年结局事件队列研究（n=58例）发现：

1. NK绝对计数(≤124.5 cells/ul)、肿瘤大小（>5cm）、肿瘤个数（多发）和AFP(>400ng/ml)是影响肝癌患者5年生存的独立危险因素；

2. 决策树（图1）显示不同危险因素中肝癌5年的生存率，且NK细胞数量在列贡献中为第二位；

图1

3. 前瞻性数据（图2）中NK细胞数量与肝癌患者1年生存率密切相关。

图2

二、肝癌患者NK细胞免疫功能耗竭与糖代谢密切相关

比较正常人、慢乙肝、肝硬化、肝癌患者NK细胞共抑制分子表达比例，肝癌患者NK细胞TIGIT+TIM3共表达显著升高，且两者显著相关。肝癌患者TIGIT+TIM-3+NK细胞存在功能耗竭（图3），且参与肝癌进展（图4）。

图3

图4

构建肝癌糖代谢评分，对TCGA和GEO数据库分析发现，糖代谢评分与NK细胞相关性最强，NK细胞参与肝癌糖代谢过程中发挥重要作用（图5）。

图5

三、基于糖代谢探讨中医药逆转肝癌NK细胞耗竭的免疫学机制研究

对中西医结合组和西医治疗组患者进行总体细胞聚类分析，再单独对NK细胞聚类分析，比较NK细胞比例，差异亚群，轨迹分析及通路富集，单细胞测序转录水平证实，养阴扶正解毒方提高NK细胞比例，主要分布在杀伤细胞亚群（图6）。进一步体内外实验证实，养阴扶正解毒方逆转肝癌耗竭NK细胞的糖代谢调控机制（图7）。

图6

图7

对接受养阴扶正解毒方治疗HBV-HCC患者随访48周后对外周血NK细胞表型的影响，发现中西医结合组患者相比于西医治疗组在总NK细胞上NKG2A/NKG2D比值有降低趋势，而抑制性受体TIM-3表达比例显著降低。说明养阴扶正解毒方可降低NK细胞共抑制分子表达水平（表型）。

图：中西医结合组治疗HBV-HCC患者外周血总NK细胞共抑制分子表达水降低（治疗48周，随访48周）

对接受养阴扶正解毒方治疗HBV-HCC患者NK细胞功能是否发生改变，检测总NK细胞及其亚群杀伤功能CD107a和分泌细胞因子IFNγ的水平。发现中西医结合组能够显著提高总NK细胞及其亚群中CD107a表达比例。进一步发现中西医结合组在前期证实的功能耗竭的TIM-3+NK细胞也能显著提高CD107a杀伤水平。说明养阴扶正解毒方可增强NK细胞杀伤功能（功能）。

图：中西医结合组和西医治疗组HBV-HCC患者外周血总NK细胞及其亚群功能比较

图：中西医结合组和西医治疗组HBV-HCC患者外周血TIM-3-NK及TIM-3+NK细胞上功能比较

进一步关注NK细胞糖代谢是否发生改变，通过糖酵解和氧化磷酸化通路的关键蛋白HK2和ATP5a，葡萄糖摄取能力及营养转运蛋白CD71、CD98、GLUT1多方面进行流式检测发现，中西医结合组能够显著提高总NK细胞糖酵解关键蛋白HK2以及葡萄糖摄取能力2-NBDG水平。而对于其他糖代谢指标未见明显差异。因此，养阴扶正解毒方可改善NK细胞糖酵解水平及葡萄糖摄取功能（糖代谢）。

图：中西医结合组和西医治疗组HBV-HCC患者外周血总NK细胞糖代谢水平比较

在肿瘤细胞共培养体系中，养阴扶正解毒方中药血清能显著提高NK细胞比例，同时可降低NK细胞共抑制分子TIM-3表达水平（表型）。PBMC+Huh7肿瘤细胞系共培养体系中，中药血清可提高NK细胞杀伤功能CD107a表达，细胞因子分泌IFN-γ的能力，提高NK细胞糖酵解水平（功能及糖代谢）。多层面证实养阴扶正解毒方增强NK细胞效应功能及糖代谢水平（图8）。

图8

体外阻断糖代谢证实，养阴扶正解毒方可通过介导NK细胞糖酵解途径，提高HK2水平进而增强NK细胞效应功能（图9）。

图9

四、总结

北京地坛医院中西医结合中心团队主要做了两方面工作：

一个是在临床疗效方面，基于NK细胞计数，构建预测模型，预测肝癌患者5年及1年的长期/短期临床预后；

另一方面，通过单细胞转录组学、临床样本（外周血/肿瘤组织）、体外细胞实验，多层面验证中医药治疗乙肝肝癌调节NK细胞糖代谢的免疫学机制。

后续会对养阴扶正解毒方进行拆方，对其中养阴组分、益气组分等作用进行探讨和研究，期待后续结果早日与大家见面。

五、专家介绍

杨志云 教授

首都医科大学附属北京地坛医院教授、博士生导师、副院长

北京市卫生系统高层次人才，北京市卫生系统高层次公共卫生技术人才，北京市医管中心“登峰”人才，第六批全国老中医专家学术经验继承人（师承姚树坤教授）

北京中西医结合肝病学会主任委员、中华中医药学会肝胆病分会常委、中国医师学会中西医结合肝病学会常委等

承担自然基金4项，以第一作者或通讯作者发表学术论文70余篇，其中SCI 38 篇

获发明专利11项，省级以上奖励3项

本文由肝胆相照平台整理，杨志云教授审阅。

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