临床方案设计需要多大样本量？

在临床方案设计中，不同的实验阶段有不同的目的，需要纳入的样本量也有不同，“越多越好”并不是一个合乎逻辑的答案，下述文章非常详细地解答了临床方案设计中的各种问题，提供给大家参考。

在人类2万多种疾病中只有一小部分可以进行准确、灵敏的诊断检测，人们迫切需要新的生物标志物来改进当前的诊断和预后分析方法。基于组织、血浆、呼出气冷凝液、唾液和尿液等生物样本的蛋白质组学分析，是发现新的生物标志物，推进各种疾病预防、诊断和治疗的有力方法。

基于质谱技术发现蛋白质生物标志物的过程中，存在大量容易忽略的问题，如研究队列的选择、统计功效的评估、样本的盲法和随机化、样本和数据的质量控制等。2021年8月，美国西北太平洋国家实验室Thomas O. Metz课题组在Nature Protocols发表了题为“Tutorial: best practices and considerations for mass-spectrometry-based protein biomarker discovery and validation”文章，描述了在生物标志物探索中每个步骤的基本原理、干扰因素和潜在问题，为提高生物标志物开发研究的严谨性和可重复性提供了参考。

内容概览

研究阶段

生物标志物的开发通常分为三个阶段：

（1）发现阶段：主要基于非靶向蛋白质组学分析，识别和量化尽可能多的蛋白质，从而筛选出数十到数百个候选生物标志物，以便在验证和确认阶段进一步评估。 但由于成本、物流、检测通量等影响因素，该阶段使用的样本量通常较为有限。

（2）验证阶段：通过靶向质谱验证疾病组和对照组之间存在显著丰度差异的目标肽。所需的样本数量取决于疾病的复杂性、先前的研究和分析试验的平台，可通过功效分析来确定。

（3）确认阶段：通过分析扩大或独立队列的相同疾病个体样本，确认生物标志物在疾病中的效用。通常，只有少数（3-10个）候选生物标志物可进入确认阶段。这一阶段通常通过免疫分析（如 ELISA）或靶向质谱分析（如果没有特异性抗体）进行。与验证阶段类似，样本数量可通过功效分析确定，并取决于多种因素，如候选生物标志物的数量等。

图1 生物标志物的研究阶段

队列选择及研究设计

（1）队列选择：准确预测疾病生物标志物的关键是选择具有代表性疾病病例样本及匹配的非疾病样本。许多疾病受性别、年龄、体重、种族/民族、合并症和既往病史的影响，因此在实验设计过程中应考虑这些因素，尽可能匹配实验组和对照组。可能需要额外的样本或比较组来解释由协变量（协变量是一个独立变量不为实验者所操纵,但仍影响响应,例如年龄）引起的多因素疾病。

（2）研究设计：观察性研究可能会使用多种不同的研究设计方法，例如动物实验、个案研究、病例对照研究、临床试验、队列研究、系统综述和荟萃分析等，每种设计具有不同程度的偏差，可通过逆概率加权或贝叶斯方法等统计方法调整偏差。

（3）功效分析：研究对象和样本数量取决于所选定的研究设计，而研究设计本身取决于科学问题和预期推论。在具有一定统计显著性的前提下，功效分析提供了一种获得所需研究对象和样本数量的估算方法。在实验设计过程中，需要权衡给定样本量下蛋白质数量和丰度差异倍数。（常用功效分析工具：G*Power）

样本收集、处理、储存、跟踪

发现阶段工作流程和注意事项



图2 发现阶段工作流中每个步骤的注意事项，图中展示了一个血浆分析示例验证和确认阶段工作流程和注意事项



图3 确认阶段工作流中每个步骤的注意事项

成功的生物标志物实例



研究讨论

生物标志物的开发是一项复杂的任务，有多个研究阶段和失败点。因为研究规划和执行过程中忽略了多种重要因素，许多已发表的生物标志物研究尚未得出结论或结论不可重复。目前样本数量少、候选物缺乏适当验证是研究中的主要挑战，这表明更优的研究设计、科学严谨性和质量控制是非常必要的。分析足量样本面临的挑战是数据通量低和成本高，但随着质谱技术的不断进步，将在分析大规模样本以开发生物标志物方面发挥重要作用。

综上，基于质谱蛋白质组学是生物标志物开发的重要手段，从研究设计到实验执行，再到数据分析每个步骤都需要严谨、规范。

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