过继细胞治疗(ACT)：ACTs使用的基因转导技术及局限性

图1 当前过继细胞疗法中的基因转导策略

ACT中的基因转导策略

ACT需要将CAR或TCR基因导入受体细胞并精确控制基因表达。一系列基因转导策略的出现推动了ACT的发展。理想的基因转导策略应该是安全的，具有较低的免疫原性，并能够携带尽可能大的基因片段，同时还允许转导的基因在受体细胞中保持稳定或长期表达。目前，ACT经常使用三种类型的基因转导策略：(1)病毒载体，包括逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体；(2)非病毒载体，如转座子、mRNA转导和DNA转导；(3)基因编辑工具，如CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN(图1)。虽然这些基因转导策略大大提高了工程免疫细胞的潜力，但它们受到插入突变、转导效果差和成本高等问题的限制。

病毒载体

γ-逆转录病毒

逆转录病毒家族包括7个成员，其中只有γ-逆转录病毒用于临床。所有逆转录病毒都有三个结构基因：编码病毒结构蛋白的gag；编码病毒复制所需的逆转录酶和整合酶的pol；编码病毒包膜糖蛋白的env3。γ逆转录病毒可以携带大量的基因货物，转导各种细胞类型，将外来基因整合到宿主的基因组中以确保持续表达，并迅速扩增生产用于临床转化。由于这些优点，γ-逆转录病毒是第一个被批准用于临床试验的病毒载体，也是第一个用于CAR-T细胞制备的载体。用携带抗CD19 CAR基因的γ逆转录病毒感染T细胞，获得了51%的CAR-T阳性细胞。这些CAR-T细胞有效地裂解CD19阳性肿瘤细胞，延长了荷瘤小鼠的生存时间。γ逆转录病毒已被广泛应用于免疫细胞治疗的临床试验，并取得了积极的结果。【Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra25】用γ逆转录病毒产生靶向CD19 CAR-T细胞，联合化疗治疗16例B细胞急性淋巴细胞白血病，CR高达88%。【N Engl J Med. 2020;382(6):545–53】用γ逆转录病毒构建表达抗CD19CAR、IL-15和诱导型Caspase-9的CAR-NK细胞，最终转导效率为49.0%(22.7-66.5%)。这些CAR-NK细胞在一项涉及11名CD19阳性肿瘤患者的临床试验中进行了测试，其中8人有反应，7人CR。此外，上市的其中两种CAR-T细胞治疗产品Yescarta和Tecartus都使用γ-逆转录病毒作为基因输送载体，证明了γ-逆转录病毒在细胞治疗产品制备中的适用性。然而，γ-逆转录病毒的整合部位往往靠近启动子，这会改变附近基因的活性。因此，如果原癌基因或抑癌基因发生整合，γ逆转录病毒有可能将健康细胞转化为癌细胞。在γ逆转录病毒的基因治疗临床试验中，一些患者经历了插入突变，导致克隆性T细胞急性淋巴细胞白血病。然而，不必过度担忧，因为这种情况不太可能经常发生。研究表明，成熟的T细胞可以通过凋亡和表观遗传机制抵抗肿瘤转化。此外，在一项涉及使用γ逆转录病毒转导T细胞治疗HIV的长期试验(＞500例患者随访)中，没有发现载体诱导细胞永生的证据。此外，如果有必要，在CAR中添加自杀元素可以消除γ-逆转录病毒整合带来的潜在转化风险。然而，由于γ逆转录病毒的缺点，如它们不能感染未分裂的细胞和对宿主转录组的较大影响，慢病毒载体在临床试验中逐渐取代了它们。

慢病毒

慢病毒载体是通过转化HIV-1构建的。慢病毒有一个独特的顺式作用元件，称为中央多聚嘌呤区(cPPT)，使它们能够有效地转导静息T细胞，而不需要进行有丝分裂。慢病毒基因组包括逆转录病毒共有的gag、pol和env，以及两个调控基因tat和rev，以及四个辅助基因vif、vpr、vpu和nef，它们负责编码病毒复制、结合、感染和释放所需的蛋白质。慢病毒载体已经更新并迭代到第三代。此外，通过加入自失活转化、减少同源序列、删除非必需基因、将病毒基因分散在不同的质粒中以及其他方法，其安全性得到了提高。第三代慢病毒载体的包装系统只保留了HIV-1基因组中的gag、pol和rev基因，这些基因分散在三个不同的质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)上。此外，慢病毒编码基因中的LTR序列被改变为自失活，以通过防止重组来进一步提高安全性。为了提高目的基因的表达，将土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)引入到3‘LTR中以稳定转录，当与cPPT结合使用时可以使目的基因的表达增加4倍。

与γ逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的应用范围更广，转导效率更高，转基因载量更大，免疫原性更低。Kymriah、Breyanzi、Abecma、Carteyva、Carvykti和CT103A都是商业CAR-T细胞产品，都使用慢病毒载体导入CAR基因。此外，慢病毒载体还被用于越来越多的细胞治疗临床试验，这些试验显示出有希望的结果。一项研究【N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17】中，30名r/r急性淋巴细胞白血病患者接受了慢病毒转导的第二代CAR-T细胞治疗。因此，90%的患者CR，6个月无事件生存率为67%，而2年总生存率为78%。【Blood J Am Soc Hematol. 2016;127(24):2980–90】使用慢病毒载体，通过感染CD4+和CD8+的Tcm亚群产生抗CD19 CAR-T细胞。这些T细胞产品被安全地应用于8名B细胞非霍奇金淋巴瘤患者，其中6人在1年内没有进展。

然而，慢病毒载体有一些局限性。例如，插入突变的风险是不可避免的，因为慢病毒载体的整合位置仍然是随机的。在临床治疗中，由于CAR插入到TET2和CBL基因中，已经有过T细胞克隆性增殖的实例。此外，慢病毒包装过程中使用的多质粒共转化系统使获取慢病毒变得困难、昂贵，并且容易在批次之间质量不一致。最后，慢病毒对某些细胞的感染效率通常很低，例如NK细胞。这些问题促使研究人员继续探索更有效的基因转移技术。

其他病毒载体

除了逆转录病毒家族，其他病毒也用于基因转导，如腺相关病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒。腺相关病毒既可以感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞，通常没有致病性或细胞毒性。与逆转录病毒载体相比，腺相关病毒的插入突变风险较低，因为它们的基因整合率较低。然而，它们受到有限的包装容量(＜5kb)的极大限制。尽管包装大小高达8kb的腺病毒也可以转导分裂和非分裂细胞，插入突变的风险很低，但它们很容易被宿主的先天性免疫反应排斥。单纯疱疹病毒是一种大容量载体(＞30kb)，具有多个外源基因插入位点，基因转导效率高，但存在免疫原性和靶向性差的局限性，转基因在某些器官(如脑中)不能长期表达。

非病毒载体

转座子

转座子是天然的可移动DNA片段，可以改变其在基因组中的位置。转座子系统包括转座酶和带有转座酶结合位点的目的基因。目的基因被转座酶切断并移动，结合目的基因两端的反向末端重复序列。转座子系统因其基因载量大、转导效率高、使用方便、免疫原性有限和工业成本低等优点而被广泛应用于学术研究和临床试验。两个最常用的转座子系统是睡美人(SB)和piggyBac(PB)，两者都是由两个表达转座酶并携带目的基因的质粒组成。转座效率与转座酶活性密切相关。通过末端重复序列和转座酶的修饰，发展出具有不同DNA切割和转座活性的转座系统，如SB系统的SB11和SB100X，PB系统的pB和7pB。

转座子系统是一种高效灵活的技术，用于对T细胞进行基因改变以进行癌症治疗。SB11转座酶已用于临床研究。在1/2期临床试验中【Immunol Rev. 2014;257(1):181–90】，利用SB11转座子产生了CD19靶向的CAR-T细胞，CAR阳性率超过90%，这些细胞显示出强大的抗肿瘤作用。然而，研究者比较SB11和SB100X的转座活性，发现SB100X在产生CAR-T细胞方面的效率大约是SB11的3.6倍，这表明SB系统在T细胞编辑方面的潜力还有待充分挖掘。此外，SB100X转座子可以通过一次电穿孔程序将多个基因成功地转移到人T细胞中，这可能在创造多靶点CAR-T细胞方面具有无与伦比的优势。此外，SB转座子已用于TCR-T细胞的开发，【Mol Ther. 2016;24(6):1078–89】使用SB11转座子构建了ERBB2突变特异性TCR-T细胞，并证明其对肿瘤细胞的有效反应和相当大的体外杀伤。

另一个有前景的T细胞工程工具是PB转座子系统。【J Immunother. 2013;36(1):3–10】使用PB转座子将eGFP基因导入T细胞，并观察到在PB修饰的T细胞中持续转基因表达超过6个月。考虑到这一点，使用PB转座子系统来生产CAR-T细胞最近变得越来越流行。例如【Mol Ther Oncolytics. 2021;20:646–58】，用外周血构建了EPHB4靶向CAR-T细胞，CAR阳性78.5%，这些细胞还表现出显著的记忆和低耗竭特性。在【Blood. 2018;132:1012】多发性骨髓瘤的1期临床试验中，使用PB系统生产的抗BCMA CAR-T细胞也显示出积极的结果，与其他类似的抗BCMA CAR-T细胞产品相比，副作用更少。

然而，转座子系统的使用也面临一些需要解决的挑战。首先，目的基因大小对SB转座子的转座效率有很大影响；当目的基因＞5kb时，转座效率显著降低。其次，依赖电转的转座子系统持续导致大量细胞死亡，并且容易整合目的基因多个拷贝。最后，由于SB转座子倾向于整合到转录单元中，而PB转座子往往整合在转录起点和CpG岛，这两个系统都面临插入突变甚至致癌的风险。在全基因组图谱研究中，PB系统被证明将目的基因整合到T细胞中已知的888个原癌基因中。此外，转座子自然允许转导基因重复改变其基因组位置，这可能导致不可预测的结果。有可能通过屏蔽转录调控元件来防止对整合位点附近基因的影响，或者通过修改转座酶来提高靶标识别的特异性，从而增加转座子系统的安全性，但这些措施尚未进行临床测试。转座子系统是否优于其他基因转导方法，特别是在安全性方面，还有待进一步研究。

mRNA转导

1、mRNA电穿孔

mRNA电穿孔是一种先修饰mRNA以增加其稳定性，然后通过电子转导将其导入细胞质进行表达的技术。电穿孔的mRNA在胞质中立即可用，不需要进入细胞核，这不仅提高了表达效率，而且消除了插入突变的可能性。因此，mRNA电穿孔可能是最安全的有效基因转导方法之一。此外，mRNA电穿孔还具有转导效率高、通用性强(可以转导几乎任何类型的细胞，包括静息或缓慢增殖的细胞以及原代免疫细胞)、易于设计和优化，以及能够以较低的成本快速生产所需细胞等优点。因此，涉及到mRNA电穿孔的研究变得越来越频繁。

【Cancer Immunol Res. 2014;2(2):112–20】通过电穿孔技术将编码间皮素CAR的mRNA导入活化的T细胞，成功地获得了临床级的CAR-T细胞，平均细胞存活率达91%以上，CAR阳性率达98%以上。这些CAR-T细胞在患者中显示出显著的抗肿瘤活性，没有明显的off-tumor/on-target毒性。这些发现支持过继转移mRNA转导的CAR-T细胞是可行和安全的。尽管目前首选的CAR-T细胞制备方法是基于逆转录病毒或慢病毒转导，但由于繁琐的制造过程，10%的患者在接受治疗之前死于疾病进展。mRNA电穿孔技术可以大大缩短临床级CAR-T细胞的制备时间，使侵袭性疾病患者能够在短时间内接受CAR-T治疗。【Cancer Immunol Immunother. 2014;63(10):999–1008】利用mRNA电穿孔技术在10天内获得足够数量的CEA特异性CAR-T细胞，经电穿孔和冷冻保存后，得到25.7±2.9%的CAR阳性T细胞。这反映了mRNA电穿孔技术在临床应用中的主要优势。

受mRNA分子固有的不稳定性的限制，mRNA电穿孔通常只引起CAR的瞬时表达。这个问题可以通过重复给患者注射mRNA转导的CAR-T细胞来解决，但这会增加治疗费用。然而，mRNA转导的CAR-T细胞的这种缺陷在安全性方面是一个优势，因为它不仅消除了插入突变的风险，而且还可能避免不可预测的反应，如由于CAR组成型表达而与正常组织的交叉反应。此外，电穿孔通常会对细胞造成不可逆转的损伤，这限制了mRNA电穿孔技术的应用。因此，研究人员正在探索其他替代方案。

2、脂质纳米颗粒介导的mRNA转导

近年来，纳米材料也被用于ACT。其中，脂质纳米颗粒(LNPs)在递送mRNA产生CAR-T细胞方面取得了良好的效果。LNPs通过内吞作用或膜融合作用进入细胞并传递mRNA。在保持与电穿孔相似的转导效率的同时，LNP表现出低细胞毒性。【Nano Lett. 2022;22(1):533–42】成功地生成LNP来源的CAR-T细胞，并在体外显示出与电穿孔来源的CAR-T细胞相当的抗肿瘤活性。然而，LNP介导的mRNA转导也面临着稳定性差、生物相容性低、降解性差以及在体内诱导副作用等问题。因此，研究人员继续寻找新的策略来解决这些限制。

3、外泌体介导的mRNA转导

活细胞分泌的外泌体含有许多功能分子，可通过相应的受体介导细胞间的物质转移和通讯。外泌体具有一些独特的优点，如结构稳定，有效地保护mRNA不被降解，免疫原性低，能够穿越血脑屏障，以及易于工程设计。因此，研究人员试图通过外泌体介导的基因转导来产生CAR-T细胞。【Cytotherapy. 2023;25:615–24】在膜上装载CAR编码的mRNA并表达抗CD3/CD28 scFvs，使得外泌体可以直接用于激活和精确地将CAR编码的mRNA输送到T细胞，以产生具有肿瘤杀伤功能的CAR-T细胞。然而，外泌体产生的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用略弱于慢病毒产生的CAR-T细胞，这可能是由于外泌体介导的CAR表达水平较低所致。此外，尽管工程化外泌体还没有在体内进行测试，但它们为体内制备CAR-T细胞提供了一种潜在的新策略，还需要进一步的优化。

DNA转导

与mRNA转导类似，在ACT中也尝试过将编码CAR的DNA传递给免疫细胞。DNA的优点是比mRNA更稳定。

1、DNA纳米载体电穿孔技术

【Sci Adv. 2021;7(16):eabf1333】通过对原始质粒pEPI的几次修饰，产生了一种名为nS/MARt的新型DNA纳米载体，编码CAR的基因可以装载在载体上并通过电穿孔转导到细胞中，可以介导目的基因的长期稳定表达。与慢病毒载体转导相比，nS/MARt介导的基因转导效率相似，但CAR的表达水平更高。在功能方面，nS/MARt产生的CAR-T细胞在体内表现出较强的浸润能力和肿瘤特异性杀伤能力。nS/MARt产生的CAR-T细胞通过电穿孔在Jurkat76细胞中诱导基因表达至少360天，反映了病毒载体介导的基因稳定表达的特征，但没有基因组整合和插入突变的风险。为了将nS/MARt产生的CAR-T细胞转化为临床应用，研究人员还设计了一种生产程序，可以提供临床级CAR-T细胞，能够在5天内从最初的1×10^9 T细胞转化为3.6×10^8功能性CAR-T细胞。这大大加速了CAR-T细胞的产生，因为使用传统的慢病毒载体产生足够数量的CAR阳性细胞需要12-14天的时间。虽然这种纳米载体还有待临床试验，但它有望对CAR-T细胞疗法的应用产生深远影响。

2、纳米颗粒介导的靶向DNA递送

产生CAR-T细胞的一种更快的方法是直接在体内制造免疫细胞。为了绕过体外生产自体CAR-T细胞的繁琐和昂贵的过程，【Nat Nanotechnol. 2017;12(8):813–20】利用携带DNA的纳米颗粒直接在体内用白血病特异性CAR基因编程宿主T细胞。这些纳米颗粒编程的CAR-T细胞可以迅速消除癌细胞，减轻B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠的肿瘤负荷。也有研究人员使用纳米复合物瘤内注射，将分泌IFN-γ的CAR编码质粒递送到具有Neuro-2a异种移植物的小鼠巨噬细胞中，在肿瘤中产生大量的CAR-M细胞(占CAR阳性细胞的82%)。在自分泌IFN-γ的帮助下，这些细胞从M2表型极化到M1表型，并通过直接吞噬肿瘤细胞和刺激抗肿瘤反应来抑制肿瘤生长。

纳米颗粒有相当大的潜力用于CAR-T细胞的制备，或作为一种辅助策略来提供转座子和基因编辑系统所需的组件。

基因编辑工具

CRISPR/Cas9

目前，慢病毒和逆转录病毒载体是细胞治疗中两种主要的基因转导工具。然而，这两个载体都可以随机整合到基因组的有问题区域，从而影响工程细胞的质量和治疗效果。因此，CRISPR/Cas9技术在减少随机插入可能性的同时，实现了精确的基因编辑，引发了广泛的兴趣。

CRISPR/Cas9系统是一种RNA引导的靶向基因编辑技术，主要由两部分组成：能够识别特定DNA序列的引导RNA(gRNA)和在目标位置切割DNA的Cas9内切酶。在gRNA的指导下，Cas9可以在靶部位精确定位和切割DNA，产生双链断裂(DSB)，从而激活两种不同的修复机制：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。当没有模板时，NHEJ可以直接连接断裂序列并导致插入、缺失或突变，而HDR途径在供体模板存在的情况下被激活以产生特定的插入、缺失或突变。除了能够进行精确的基因编辑外，CRISPR/Cas9系统还具有几个优点，包括设计简单、实施迅速、成本低和出色的可扩展性。正因为如此，CRISPR/Cas9系统的应用已经扩展到几乎所有的基因组靶点，也加速了工程细胞治疗的发展。

CRISPR/Cas9系统已显示出在CAR-T和TCR-T细胞治疗中的潜力。由于CRISPR/Cas9能够在多个位点同时进行基因编辑，因此被认为是生产通用CAR-T细胞的突破性基因编辑工具。【Cell Res. 2017;27(1):154–7】使用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞中的TRCA(编码内源性TCRα亚基)和B2M(编码MHC-I分子的必需亚基)，产生通用的CAR-T细胞，大大减少小鼠模型中的肿瘤生长。CRISPR/Cas9系统也可用于通过删除免疫抑制基因或将CAR表达片段引入特定的位点来增强CAR-T细胞的功能。【Front Med. 2017;11(4):554–62】使用CRISPR/Cas9构建了LAG-3缺陷的CAR-T细胞，发现这些细胞在体外和体内都具有很强的抗肿瘤活性。【Clin Cancer Res. 2017;23(9):2255–66】采用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术生产不含TCR、MHC-I和PD-1的CAR-T细胞，这些CAR-T细胞在体内表现出降低的同种异体反应性和增强的抗肿瘤活性。【Nature. 2017;543(7643):113–7】利用CRISPR/Cas9技术将CD19特异的CAR编码序列定向到TRCA基因座，使其处于内源调控元件的调控之下。这不仅导致了均一的CAR表达，而且通过避免CAR强直信号，在单次或重复暴露于抗原后建立有效的CAR内化和再表达，以及延缓效应T细胞的分化和耗竭，提高了T细胞的效力。最后，CRISPR/Cas9技术还为TCR-T细胞治疗中内源性和外源性TCR潜在竞争和形成混合二聚体的问题提供了解决方案。【Blood. 2018;131(3):311–22】利用CRISPR/Cas9技术去除T细胞中的天然TCR并引入抗癌活性TCR，转基因TCR的表面表达和TCR-T细胞对抗原的敏感性均显著提高。

然而，使用NHEJ和/或HDR介导的基因整合的CRISPR/Cas9系统并不是没有缺点。HDR介导的基因整合很少发生，而大基因片段的插入是工程细胞治疗所必需的，这使得获得足够的编辑细胞变得更具挑战性。尽管NHEJ引起的DNA整合频率是HDR的1000多倍，但NHEJ介导的DSB修复在插入/缺失后容易发生移码突变，导致基因开放阅读框中断和提前终止。此外，研究表明，CRISPR/Cas9介导的基因编辑具有潜在的脱靶效应，即DNA双链切割发生在靶点之外，并通过激活细胞NHEJ修复机制导致随机插入/缺失突变。最后，CRISPR/Cas9介导的免疫细胞多基因编辑需要同时引入编码Cas9和gRNAs的多个基因，通常会产生具有不同敲除表型组合的多个细胞群体。例如，用碱基编辑软件BE4进行mRNA介导的编辑对T细胞中的TRAC、PDCD1和B2M进行基因敲除，仅产生21.9±.1%的三重敲除细胞，并伴有较大比例的单、双敲除细胞。优化后，三重敲除细胞比例提高到80%以上，并产生抗CD19 CAR-T细胞。总体而言，这些现有的技术缺陷限制了CRISPR/Cas9技术在免疫细胞治疗中的广泛使用。然而，Cas9递送效率和编辑精度的提高可以在未来推动CRISPR/Cas9技术的重大进步。

TALEN

除了CRISPR/Cas9系统外，TALEN和ZFN还可以精确编辑基因。虽然两者都已用于细胞治疗，但它们的主要应用是敲除T细胞中的TCR、MHC或CD52基因，以产生通用的CAR-T细胞。TALEN是一种人工修饰的限制性内切酶，它包括一个含有核定位信号的N-末端结构域、一个含有能识别特定DNA序列的典型串联重复序列的中央结构域，以及一个带有FokI内切酶的C-末端结构域。通过DNA识别模块，TALEN与靶DNA位点结合，使用FokI核酸酶创建DSB，并与CRISPR/Cas9类似，使用固有的HDR或NHEJ修复过程来插入或删除特定序列。

TALEN技术已被用于产生通用CAR-T细胞。【Sci Transl Med. 2017;9(374):eaaj2013】在使用慢病毒载体将CD19特异性CAR导入T细胞后，使用TALEN敲除TRAC和CD52并构建通用CAR-T细胞(UCART19)。将这些UCART19细胞输注给2例CD19+B细胞急性淋巴细胞白血病患儿，28天内分子缓解，UCART19细胞在治疗过程中持续存在。此外，【Nat Commun. 2022;13(1):3453】通过TALEN介导的基因编辑和AAV6依赖的基因插入，同时干扰和改变内源性TRAC和B2M的用途，以产生表达CAR和NK抑制剂HLA-E的TCR和HLA-ABC缺陷T细胞。这些低免疫原性通用CAR-T细胞阻断GvHD反应，避免被NK和同种异体反应性T细胞破坏，延长了它们的抗肿瘤活性。这些研究显示了TALEN在免疫细胞治疗方面的潜力。值得注意的是，TALEN的编辑效率与CRISPR/Cas9不相上下，甚至更好。据报道，TALEN在异染色质区域表现出与Cas9相当甚至更好的编辑效果。在某些情况下，TALEN的编辑效率可以超过CRISPR/Cas9系统的5倍。Cas9在编辑基因组中具有高转录活性的常染色质位点方面似乎更有效。这表明，对于一些难以编辑的基因区域，TALEN可能是一个更好的选择，研究人员可以根据目标位置选择合适的基因编辑方法。

ZFN

ZFN是一种由锌脂蛋白和FokI核酸内切酶结构域组成的融合蛋白，可与DNA特异识别和结合。与TALEN类似，ZFN系统也可以介导目的基因的特定DSB，然后可以通过NHEJ或HDR途径进行修复，导致基因敲除或插入。ZFN已成功应用于同种异体CAR-T细胞的制备。早在10年前，使用SB系统将CD19特异性CAR导入T细胞，然后应用ZFN系统永久删除TCR或HLA-A。因此，证明了这些抗CD19 CAR-T细胞不仅保持了抗肿瘤活性，而且还改善了GvHD或逃避宿主T细胞识别，为制备通用CAR-T细胞提供了基础。最近，【Nat Commun. 2022;13(1):3453】利用ZFN系统通过将抗IL13Rα2 CAR电导入同种异体T细胞，并使用Ad5/F35载体递送的ZFN敲除糖皮质激素受体，成功地产生了现成的、具有类固醇抗性的CAR-T细胞。在选择地塞米松后，这些细胞显示出对地塞米松耐药的效应活性，但没有证据表明体外同种异体反应。此外，这些细胞耐受性良好，在6名接受治疗的研究参与者中有4人在输注部位产生了短暂的肿瘤缩小和/或肿瘤坏死，表明这种ZFN修饰的细胞用作现成的同种异体CAR-T细胞产品是安全和可行的。

然而，尽管TALEN和ZFN具有介导基因插入的能力，但由于需要解决的某些缺点，这一特征目前并未应用于ACT，其中最突出的是相对低效。此外，与CRISPR/Cas9相比，TALEN和ZFN更昂贵、更难操作、更耗时，限制了它们的广泛应用，特别是在免疫细胞治疗方面，这需要大规模制备工程免疫细胞。因此，在现有的细胞治疗临床研究中，TALEN和ZFN主要作为基因敲除的辅助技术。

基因转导是工程细胞治疗的基础和前提，因为它对工程细胞的数量和质量有很大的影响。一种好的基因转导方法应该是高效、安全、简单和负担得起的，但目前还没有一种可用的技术具备所有这些特点。随着免疫细胞疗法的发展，将会有更多的免疫细胞类型被工程化。因此，对可靠的转导技术的需求越来越大。因此，优化现有的技术并研究高效、安全、简单、廉价和能够广泛的细胞趋向性的新技术是迫切需要的。在开发出适用于不同细胞类型和货物特征的足够数量的转导技术后，多种免疫细胞疗法将迅速发展。

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