消化系统肿瘤患者围术期神经认知障碍潜在致病基因的筛选
来源:中华麻醉学杂志
围术期神经认知障碍(PND)是一种常见的手术麻醉相关并发症,主要指麻醉手术后认知功能减退,最新定义为整个围术期的认知功能减退[ 1 ]。PND临床表现为注意力、定向力、学习和记忆等方面的功能障碍,流行病学资料显示其发生率约为18%~45%[ 2 ]。PND可影响术后恢复,延长住院时间、增加医疗费用,降低患者生活质量,甚至增加患者死亡率,给患者、家庭和社会造成较大的负担。目前,PND的发生机制尚不清楚,高龄、全身麻醉、较长的手术时间、睡眠障碍等是其危险因素[ 3 ]。流行病学数据显示,非心脏手术PND发生率一般为6%~26%[ 4 ],但近期有研究显示,消化系统肿瘤患者PND发生率达30%以上,可能与肿瘤患者年龄因素、肿瘤免疫机制、手术麻醉时长等有关[ 5 , 6 ]。PND的术前预测性分子标志物包括Aβ蛋白、Tau蛋白[ 7 ]及ApoEε4基因[ 8 ]等,但灵敏度和特异度不理想,限制其临床预测价值。本研究基于生物信息学理论和组学大数据挖掘方法筛选消化系统肿瘤患者PND的潜在致病基因,为后续针对性防治提供参考。
材料与方法
数据获取
人食管癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌和肝细胞癌基因表达数据来自肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库,样本量见 表1。肿瘤组织相对癌旁组织的差异表达基因筛选通过GEPIA2平台完成,设定筛选阈值|log2FC|=1,q-value=0.01,筛选算法选择LIMMA。人分泌蛋白组(secretome)基因列表从人类蛋白数据库获取。PND相关基因从GeneCards数据库获取,输入检索词"perioperative neurocognitive disorder"、"postoperative cognitive dysfunction"分别检索,设定相关性评分≥1分,将检索结果取并集。
表1本研究纳入的消化道肿瘤种类和样本量
消化系统肿瘤一致性差异表达基因获取将上述5类消化系统肿瘤基因表达数据库筛选出的差异表达基因按照表达上调基因与表达下调基因进行整理,利用R语言程序包VennDiagram计算5类肿瘤一致性表达上调基因和一致性表达下调基因。
消化系统肿瘤一致性分泌蛋白组基因获取利用VennDiagram程序包分别计算一致性表达上调基因、一致性表达下调基因与人类分泌蛋白组基因的交集,获取消化道肿瘤一致性分泌蛋白组基因。
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因的确定利用GeneCards数据库检索PND相关基因,考虑到PND过去名称为POCD,因此利用检索式:[all](perioperative AND neurocognitive AND disorder) OR [all](postoperative AND cognitive AND dysfunction) OR [all](PND) OR [all](POCD)获取PND相关目的基因。利用VennDiagram程序包计算PND相关基因与消化道肿瘤一致性分泌蛋白组基因的交集,确定消化道肿瘤中PND潜在致病基因。
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因蛋白互作(PPI)网络构建与分析
将消化系统肿瘤中PND潜在致病基因导入STRING数据库,选择物种为智人(Homo sapiens),置信度设为0.4,构建基因的PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape软件进行拓扑学分析,选择Degree、Betweeness、Closeness与Matthews correlation coefficient(MCC)四种算法筛选枢纽基因。
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因的基因本体论(GO)富集分析
利用R语言Bioconductor系列程序包ClusterProfiler进行GO富集分析,分析消化系统肿瘤中PND潜在致病基因在生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)三个方面可能发挥的作用,并根据统计学指标进行排序。
图1 研究方案与分析流程
注:PPI为蛋白质相互作用,GO为基因本体论,KEGG为京都基因和基因组百科全书
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因的京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析
利用R语言Bioconductor系列程序包ClusterProfiler进行KEGG富集分析,分析消化系统肿瘤中PND潜在致病基因主要富集于哪些信号通路,利用R语言Pathview程序包对信号通路进行可视化,并将上述基因在这些信号通路中的作用位点进行标注。
数据分析与统计学处理 利用RStudio软件基于R语言进行数据分析与处理,差异表达基因的筛选遵循统计显著性度量和变化倍数相结合,GO和KEGG富集分析采用超几何分布检验;显著性指标设定为:|log2FC|>1,P<0.05,Q<0.01。
结果
人食管癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌和肝细胞癌的差异表达基因
与正常组织相比,食管癌样本中2 640个基因表达上调,1 423个基因表达下调;胃癌样本中3 748个基因表达上调,908个基因表达下调;结肠癌样本中2 684个基因表达上调,2 678个基因表达下调;直肠癌样本中2 876个基因表达上调,2 945个基因表达下调;肝癌样本中1 484个基因表达上调,723个基因表达下调。
消化系统肿瘤一致性差异表达基因数量
对上述5类肿瘤样本的表达量取交集后,得到消化系统肿瘤一致性表达上调基因254个,一致性表达下调基因81个。见 图2 。
图2 消化系统肿瘤一致性差异表达基因数量韦恩图
注:ESCA为食管腺癌,STAD为胃腺癌,COAD为结肠腺癌,READ为直肠腺癌,LIHC为肝细胞癌
消化系统肿瘤一致性分泌蛋白组基因数量
与正常组织相比,消化系统肿瘤一致性表达上调分泌蛋白组基因53个,一致性表达下调分泌蛋白组基因20个。见 图3 。
图3 消化系统肿瘤一致性分泌蛋白组基因数量
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因数量
通过GeneCards数据库获取PND相关基因1 977个。与正常组织相比,PND潜在致病基因23个,其中表达上调基因20个,表达下调基因3个。见 图4 。
图4 消化系统肿瘤中PND潜在致病基因数量
消化系统肿瘤中PND潜在致病基因PPI网络特征
去除无互作关系的孤立基因,PPI网络共包含节点18个,连线27条,平均节点度值为1.5。将度值大于平均值的节点确定为枢纽基因,即MMP9、CXCL10、SPP1、CCNA2、CDKN2A、SPARC、CCL18、CXCL9、DPIA3、PRKDC、E2F1、TGFB1、PLAU。PPI网络和四种算法对枢纽基因排序见 图5 。
图5 消化系统肿瘤中PND潜在致病基因PPI网络特征
注:Degree为点度中心性,Betweeness为中介中心性,Clossness为接近中心性,MCC为马修斯相关系数;MMP9为基质金属蛋白酶-9,SPP1为分泌磷蛋白-1,CXCL10为趋化因子10,SPARC为富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白,CDKN2A为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A,CCNA2为细胞周期蛋白A2,PDIA3为二硫键异构酶A3,CXCL9为趋化因子9,CCL18为趋化因子CC配体18,PLAU为尿激酶,TGFB1为转化生长因子B1,E2F1为转录因子E2F1,PRKDC为DNA蛋白激酶的催化亚基,HLA-A为HLA I类组织相容性抗原,IL-32为白细胞介素32,AGER为晚期糖基化终产物受体,GABBR1为γ-氨基丁酸B型受体。
GO富集分析结果
GO分析结果显示,以P<0.05和Q<0.01为阈值,消化系统肿瘤中23个PND潜在致病基因在分子功能方面主要影响受体-配体结合、信号受体激活剂活性、细胞因子活性、趋化因子活性、细胞外基质融合、胶原结合、趋化因子受体结合、G-蛋白耦联受体结合、整合素结合能力等;这些基因编码的蛋白主要集中于胶质细胞外基质、内质网膜等部位;主要参与成肌细胞融合的调节、白细胞迁移、质膜融合对合胞体形成的调控、髓系白细胞迁移、中性粒细胞趋化性、中性粒细胞迁移、粒细胞趋化性、成肌细胞融合、成纤维细胞增殖的正向调节、粒细胞迁移等多种生物学过程。见图6 。
图6 基因本体论富集分析结果
KEGG通路富集分析结果
KEGG分析结果显示,以P<0.05和Q<0.01为阈值,消化系统肿瘤23个PND潜在致病基因中有18个基因富集在24条信号通路中,主要包括:EB病毒感染信号通路、膀胱癌信号通路、细胞周期信号通路、细胞老化信号通路、细胞因子与其受体结合的信号通路等。见 图7 。
讨论
本研究采用生物信息学分析方法和数据挖掘技术,通过挖掘五类消化系统肿瘤的分泌蛋白组基因表达数据,并与PND相关基因进行比对,发现消化系统肿瘤基因表达谱中23个潜在的PND致病基因,并从中筛选出枢纽基因和相关信号通路。在23个潜在致病基因中,MMP9、TGFB1和CXCL家族成员(CXCL9/10等)表达显著上调。该结果与文献报道的认知功能障碍模型中MMP9、TGFB1和CXCL家族表达量的变化一致[ 9 , 10 ]。
MMP9在本研究的PPI网络分析结果中处于核心地位,提示MMP9是消化系统肿瘤PND潜在致病基因中的枢纽基因。MMPs是机体内源性酶,MMP9是其中功能较为活跃的一员[ 11 ]。在生理状态下发挥调控海马突触可塑性的功能以及参与学习记忆过程[ 12 ],病理状态下参与细胞外基质破坏、炎症浸润和血脑屏障破坏,目前有较多基础研究和临床试验发现其在术后认知障碍、缺血性脑损伤后认知障碍、血管性认知功能障碍中表达上调[ 9 , 13 ]。本研究通过筛选发现,在5种消化系统肿瘤的PND潜在致病基因中,MMP9一致性高表达,且与CXCL10、CDKN2A、SPARC等基因存在明确的相互作用,提示在转录水平抑制MMP9表达可作为今后防治PND的重要目标。
在筛选得到的一致性上调基因中,CCL18、CXCL9和CXCL10编码趋化因子。中枢神经系统炎症反应是PND的主要机制之一,其中星形胶质细胞的激活发挥重要作用。在中枢慢性炎症微环境下,星形胶质细胞被激活,释放炎症因子和趋化因子,进而激活小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞等炎症细胞,形成正反馈,释放大量趋化因子(CCL2、CCL5、CXCL10等),导致认知功能减退[ 14 ]。CXCL9和CXCL10基因位于染色体4q21.1上的CXCL聚集区,其共同受体为CXCR3。CXCL9和CXCL10在正常的中枢神经细胞中不表达,但在中枢神经炎症及退行性变时表达上调[ 10 ]。目前有研究表明,在阿尔兹海默症小鼠模型中,通过调节免疫功能从而抑制CXCL9、CXCL10与其受体CXCR3的作用,可减轻神经炎症并改善认知功能[ 15]。目前在PND的研究领域尚未发现CXCL9、CXCL10与其受体CXCR3的相关研究。本研究结果提示,在转录水平抑制CXCL9、CXCL10表达,以及寻找CXCR3的竞争性拮抗剂,或将成为未来防治PND的新策略。
TGFB1基因编码TGF-β1,是一种参与神经元发育和突触可塑性的营养因子。有研究表明,TGF-β1信号通路可作用于小胶质细胞,与阿尔兹海默症Aβ蛋白沉积加剧和神经原纤维缠结形成有关,加重神经退行性变[ 16 ]。目前对PND病理生理机制的研究认为:小胶质细胞的激活和毒性产物的释放,是PND的关键致病因素,与阿尔兹海默症类似。目前尚无TGF-β1与PND关系的研究报道,今后TGFB1基因可作为PND的干预靶点。
在筛选得到的一致性下调基因中,AGER基因编码晚期糖基化终产物受体,其特异性配体晚期糖基化终产物(AGEs)是阿尔兹海默症等疾病的关键致病因素[ 17 ]。AGER基因下调提示一种自我保护机制:通过减少受体数量,减弱AGEs介导的PND致病因素。
GO富集分析结果提示肿瘤微环境通过炎症介质参与PND的发病。中枢神经系统炎症以及全身性炎症对中枢的影响是PND的重要病理基础[ 18],肿瘤微环境中存在大量的免疫和炎症细胞、细胞因子、趋化因子等,是全身炎症反应的介质。本研究筛选的PND潜在致病基因影响受体-配体结合、信号受体激活剂活性、细胞因子活性、趋化因子活性等,进而参与粒细胞的迁移和趋化性等生物过程,可能影响基于炎症反应的PND发病机制。
KEGG分析结果中,细胞周期、细胞老化、细胞因子与其受体结合三条信号通路引起关注,神经退行性变是PND的重要病理生理基础,细胞老化在中枢神经系统突触可塑性和认知功能障碍中发挥重要作用,且细胞老化在年龄相关退行性变和肿瘤发生等病理生理机制中具有共同机制[ 19 , 20]。
本研究的肿瘤和正常组织样本来自TCGA数据库,全部为接受手术麻醉的患者,筛选出的23个差异表达基因,受到肿瘤因素与手术麻醉因素的双重影响,但肿瘤因素为长期影响,推测其对PND的发病与临床表现具有更为显著影响。通过文献学习发现,23个差异表达基因对肿瘤临床表型及预后的影响均有报道,如果通过恰当方式调控上述基因表达,理论上预测其具有抗肿瘤与预防PND的双重优势。
本研究主要基于组学数据的筛选,通过文献回顾,主要研究结果可以在部分文献中得到验证,据此提出上述猜想,作为目标基因筛选的一种策略。本研究筛选出的部分分泌蛋白组差异表达基因,其编码的蛋白是否参与PND的发病与临床表现,需要进一步的实证研究,此项不足将在后续研究中通过PND动物模型实验和临床试验加以完善。
综上所述,通过生物信息学分析发现消化系统肿瘤差异表达的基因中有23个与PND潜在相关,其中MMP9、CXCL9、CXCL10等在消化道肿瘤中显著高表达,可能是消化道肿瘤患者发生PND的枢纽基因,主要作用于受体-配体结合能力、细胞因子和趋化因子相关的生物过程和细胞周期、细胞老化、细胞因子与其受体结合等信号通路,推测其通过上述机制参与该类疾病患者PND的病理生理过程。
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END
编辑:Michel.米萱
校对:MiSuper.米超
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