刘颖 | 不同长骨制备的脱矿骨基质中BMP-2含量测定及其成骨性能的体外研究

赵永杰1，尹刚1，杜瑞1，王丽敏2，邓明明1，关国锋1，孙广超1，刘颖1 

1. 滨州医学院附属医院足踝外科（山东滨州  256603）

2. 北京威达峰医学生物材料有限责任公司（北京  102200）

通信作者：刘颖

关键词：脱矿骨基质；BMP-2；细胞增殖；成骨分化

引用本文： 赵永杰, 尹刚, 杜瑞, 等. 不同长骨制备的脱矿骨基质中BMP-2含量测定及其成骨性能的体外研究. 中国修复重建外科杂志, 2023, 37(8): 945-951. doi: 10.7507/1002-1892.202303132 

摘要

目的

测量不同长骨制备的脱矿骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中BMP-2 的浓度，评价不同DBM 诱导MC3T3-E1 细胞成骨分化的能力。

方法

取同一尸体标本不同长骨制备DBM，按取材部位分成尺骨组（uDBM 组）、肱骨组（hDBM 组）、胫骨组（tDBM 组）和股骨组（fDBM 组），以煮沸后的DBM 为对照组（cDBM 组）。将各组DBM 经盐酸胍提取蛋白后采用ELISA 法检测BMP-2 含量；然后将其与MC3T3-E1 细胞共培养，细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法观察各组细胞增殖情况，行茜素红、ALP、Van Gieson 染色定性观察和ALP 含量定量分析各组细胞成骨分化能力；并采用线性回归分析DBM 中BMP-2 浓度对细胞合成ALP 的影响。 

结果

各DBM 组间BMP-2 浓度比较差异均有统计学意义（P<0.05），下肢长骨中BMP-2 浓度高于上肢长骨，其中fDBM 组BMP-2 浓度约为uDBM 组的35.5 倍。CCK-8 法检测示，共培养5 d 内各组细胞持续增殖，5 d 时各组吸光度（A）值从高到低依次为fDBM 组>tDBM 组>hDBM 组>uDBM 组>cDBM 组。共培养14 d，各组细胞表达ALP、钙化结节和胶原纤维的程度与DBM 中BMP-2 浓度分布趋势一致。ALP 含量从低到高依次为cDBM 组<uDBM 组<hDBM组<tDBM组fDBM组，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。线性回归分析示，y=0.361+0.017x，DBM 中BMP-2 浓度对细胞ALP 含量的影响有统计学意义（t=3.552，P=0.005）；BMP-2 浓度每增加1 ng/g，ALP 含量将增加0.017 ［95%CI（0.006，0.027）］ U/100 mL。

结论

不同长骨中天然BMP-2 浓度差异较大，下肢长骨高于上肢长骨，骨骼取材部位是影响DBM 骨诱导能力的重要因素。

正文

骨不连占所有骨折术后并发症的1.9%～10%，长骨骨折后骨不连发生率更是高达20%[1]。骨移植是一种利用骨组织材料进行骨缺损重建的技术，常用于骨不连的治疗。自体髂骨由于兼具骨传导性、骨诱导性和细胞成骨活性，一直以来是骨移植不可替代的材料；但因取骨量有限、供区疼痛、手术时间延长等缺点，限制了其临床应用[2]。脱矿骨基质（demineralized bone matrix，DBM）是由皮质骨经过脱矿制备而成，有利于骨基质中生长因子尤其是BMP的释放，从而发挥优于皮质骨的骨诱导性能。自1965年Urist首次报道以来，DBM被广泛应用于骨科和口腔颌面外科领域[3-4]。然而，不同的市售DBM产品其骨诱导性能在细胞实验、动物实验以及临床应用中表现出了显著差异，而这种差异主要与DBM中BMP含量有关。研究表明DBM中BMP含量受到供体、表面形貌、残余钙含量、载体、灭菌方法和储存条件等诸多因素的影响[4-7]，由于不同研究之间DBM的异质性，对DBM中BMP的含量及其骨诱导能力无法做出直接比较。

为了消除制备工艺这一变量因素，Bae等[8]比较了来自同一骨库的DBM中BMP浓度，发现同种DBM产品不同批次间BMP的浓度变异性显著高于不同产品之间BMP的浓度变异性，即产品内变异性高于产品间变异性。为了进一步消除供体因素，他们进一步将来自特定供体的10个批次DBM植入40只大鼠体内，进行后外侧腰椎融合术，8周后脊柱融合率在不同批次间有显著差异[9]。此时供体来源及处理工艺不再是变量，导致DBM骨诱导能力差异的最大原因可能是具体取材的骨骼部位。由此，我们提出以下假设：取材部位是导致DBM中BMP含量差异的另一重要原因，即不同皮质骨中天然BMP的含量不等；由取材部位引起的DBM中BMP含量差异足以导致不同DBM之间成骨活性的变异。为了验证以上假设，本研究选取来自单一供体不同骨骼部位制备的DBM作为实验对象，依次消除供体因素和制备工艺两个变量，实现样本的同质化处理。通过ELISA法测定由同一供体不同长骨皮质骨制备的DBM中BMP-2含量，进一步通过细胞实验评估不同DBM的骨诱导能力。

1、材料与方法

1.1实验材料及主要试剂、仪器 

小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）（天津市骨科研究所提供）。成年男性尸体标本1具（生前无代谢性疾病）作为供体，由北京威达峰医学生物材料有限责任公司提供。人BMP-2 ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翔圣生物科技有限公司）；ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所）。酶标仪（Molecular Devices公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2不同DBM制备 

取尸体标本胫骨、肱骨、尺骨骨干的皮质骨部分，依次经清洗、脱脂、冻干后，粉碎成直径315～710 μm的骨粉，然后浸入0.6 mol/L HCl中脱矿25 min，经PBS（pH=5.5～7.5）漂洗后再次冻干。通过原子吸收光谱法测定DBM中的残余钙浓度为2%（W/W）。最后对DBM骨粉进行病毒灭活、超声清洗、冷冻干燥、包装，辐照灭菌处理后备用。按照取材部位不同，将DBM样本分为股骨组、胫骨组、肱骨组、尺骨组，分别记为fDBM、 tDBM、hDBM和uDBM；同时将煮沸后的DBM设为对照组，记为cDBM。

1.3DBM蛋白组分提取 

将300 mg DBM样品浸泡于5 mL 4 mol/L盐酸胍（GuHCl）/0.05 mol/L Tris-HCl（pH=7.4）中，4℃下持续提取24 h，随后以20 000×g离心15 min，收集上清液。然后将沉淀物重悬于5 mL新鲜GuHCl/Tris-HCl溶液中5 h，再次同上法离心并收集上清液。将两次上清液混合后，于4℃下用相对分子质量10×103截止膜在500 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液中透析15 h；然后更换等量新鲜Tris-HCl溶液继续透析10 h。最终透析袋中的液体为可提取的蛋白质组分，将其转移至新的离心管中，并测量体积。每组DBM样本分别进行3次独立提取。

1.4DBM中BMP-2浓度测定 

按照人BMP-2 ELISA试剂盒说明书操作，标准品和样品均设复孔，采用酶标仪进行双波长（450、570 nm）测定，其在450 nm波长的测定值减 570 nm波长的测定值作为校准后的吸光度（A）值。通过绘制标准曲线计算各组DBM中BMP-2浓度。每组DBM样本独立测定3次，取均值。该浓度值与各组蛋白提取液体积的乘积再除以DBM样本量（300 mg），记为每组DBM中BMP-2浓度。

1.5CCK-8法检测细胞增殖 

将5组DBM按0.5 mg/mL浓度[10]加入24孔培养板（含10%FBS的DMEM培养液）中，每组设3个平行孔。按1×104个/孔密度接种小鼠MC3T3-E1细胞，于细胞培养箱内孵育，每隔2 d更换培养液。共培养1、3、5 d后弃培养液和骨粉，依次加入400 μL新鲜DMEM培养液和40 mL CCK-8试剂（体积比为10∶1），使用酶标仪测量各组在波长450 nm处的A值。 

1.6细胞成骨分化检测 

1.6.1茜素红、ALP、胶原染色观察

将小鼠MC3T3-E1细胞以1×104个/孔密度接种于含有分化培养基（10 mmol/L β-磷酸甘油酯、1×10-8 mol/L地塞米松和50 μmol/L L-抗坏血酸的DMEM培养基）的6孔培养板中，之后各组加入等量DBM（浓度为0.5 mg/mL）。共培养14 d后弃培养液和骨粉，分别加入BCIP/NBT ALP显色液、0.1%茜素红染色液（pH=8.3）和Van Gieson试剂，倒置相差显微镜下观察细胞成骨分化情况。

1.6.2ALP含量测定

取上述共培养14 d弃培养液和骨粉的细胞悬液，加入0.2%Triton X-100溶液裂解细胞，将裂解液以离心半径5.5 cm、1 000 r/min离心10 min，收集上清液，使用ALP试剂盒（微量酶标法）测定各组细胞ALP活性。

1.7统计学方法 

采用SPSS25.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。采用线性回归分析DBM中BMP-2浓度对细胞合成ALP的影响。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1DBM中BMP-2浓度检测 

fDBM、tDBM、hDBM、uDBM组中BMP-2浓度分别为（21.763±0.344）、（3.293±0.268）、（0.848±0.051）、（0.613±0.053）ng/g，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。下肢长骨中BMP-2浓度高于上肢长骨，其中fDBM组BMP-2浓度约为uDBM组的35.5倍。

2.2CCK-8法检测细胞增殖 

各组A值均随培养时间延长而增加，3 d后增加速度明显加快。共培养1 d，5组A值比较差异均无统计学意义（P>0.05）；3 d，4个实验组A值均显著高于对照组（P<0.05），各实验组间差异无统计学意义（P>0.05）；5 d，A值从高到低分别为fDBM组>tDBM组>hDBM组>uDBM组>cDBM组，4个实验组A值均显著高于对照组，fDBM组显著高于其余3个实验组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图 1 CCK-8法检测各组细胞增殖情况

2.3细胞成骨分化检测 

2.3.1茜素红、ALP、胶原染色观察发

共培养14 d，染色示cDBM组无红色钙结节生成，uDBM组和hDBM组可见散在钙化结节，tDBM组和fDBM组可见片状钙化结节。见图2。ALP染色示cDBM组细胞铺满整个视野，未被染成紫色；uDBM组和hDBM组可见少许局部区域被染成紫色；tDBM组和fDBM组紫色面积明显增多。见图3。Van Gieson染色示cDBM组和uDBM组细胞排列疏松，仅可见少量红色胶原成分形成；hDBM组、tDBM组和fDBM组细胞呈梭形排列，数量较另外两组增加，且红色胶原成分明显增多。见图4。

图 2共培养14 d各组细胞茜素红染色观察（倒置相差显微镜×100）a. cDBM组；b. uDBM组；c. hDBM组；d. tDBM组；e. fDBM组

图 3 共培养14 d各组细胞ALP染色观察（倒置相差显微镜×100）a. cDBM组；b. uDBM组；c. hDBM组；d. tDBM组；e. fDBM组

图 4共培养14 d各组细胞Van Gieson染色观察（倒置相差显微镜×200）a. cDBM组；b. uDBM组；c. hDBM组；d. tDBM组；e. fDBM组

2.3.2 ALP含量测定

fDBM、tDBM、hDBM、uDBM、cDBM组ALP含量分别为（0.706±0.025）、（0.544±0.014）、（0.468±0.024）、（0.168±0.005）、（0.037±0.009）U/100 mL，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。 

2.4 DBM中BMP-2浓度对细胞合成ALP的影响 

线性回归分析示，y=0.361+0.017x。DBM中BMP-2浓度对细胞ALP含量的影响有统计学意义（t=3.552，P=0.005）；BMP-2浓度每增加1 ng/g，ALP含量将增加0.017 ［95%CI（0.006，0.027）］ U/100 mL。见图5。

图 5 DBM中BMP-2浓度和细胞表达ALP含量的线性回归分析

3、讨论

3.1BMP-2在不同长骨皮质层中的分布特征 

存在于骨基质中的BMP小分子蛋白，是DBM能够发挥骨诱导能力的关键生物因子。Murray团队成功提出了一种采用BMP-2浓度预测DBM成骨能力的数据统计模型，结论指出BMP-2水平是预测DBM成骨能力的最佳单一因子，其他生长因子的值仅在很小程度上影响着BMP-2的预测能力[11]。决定DBM骨诱导能力的因素不是BMP在DBM中的天然含量，而是其可释放量。胡侦明团队对新鲜小牛皮质骨进行了连续4次BMP提取，并将每次提取物与C2C12细胞共培养，观察14 d后细胞的ALP活性，结果显示第1次提取物诱导细胞表达ALP的活性显著高于第2～4次提取物，表明每次提取都能够有效分离出BMP成分[12]。

我们的实验结果表明，由不同长骨制备的DBM中BMP-2浓度差异显著，BMP-2在下肢长骨的分布浓度远远高于上肢长骨，其中股骨DBM中BMP-2浓度约为尺骨DBM中的35.5倍。分析原因可能是与BMSCs类似，不同骨骼中BMP-2的分布在胚胎阶段就是异质的。既往一项动物实验表明，细胞的增殖能力和归巢效率取决于BMSCs的微解剖位置[13]。Siclari等[14]试图使用独特的酶消化法单独分离骨内膜骨髓并进行细胞集落形成单位测定，发现即使在相同长骨内，邻近骨内膜骨髓也含有比中央骨髓更高浓度的MSCs，他们将这一现象归因于不同的骨重塑率。由于BMP-2可作用于BMSCs并诱导其分化为成骨细胞，而且可趋化破骨细胞，因此我们推测不同长骨中BMP-2浓度也与其不同的骨重塑率有关。此外，即使在个体出生后，长骨中BMP-2的含量也可能发生变化。下肢的长骨是承重骨，而上肢的长骨主要是连接骨，前者具有特殊的生物力学环境。我们推测可能存在另外一种解释，即出生后的生物力学改变了不同长骨的重塑微环境，导致BMP-2在下肢骨和上肢骨的分布不同，也许这种差异只发生在人类长骨中，而不发生在四足动物上。虽然导致BMP-2在不同长骨中差异分布的根本原因还需要进一步基础实验来阐明，但本研究结果至少可以为不同DBM产品中BMP-2的浓度及其骨诱导能力的变异性提供更深层次、更强有力的理论依据。 

3.2不同BMP-2浓度的DBM对促进细胞增殖的影响 

本研究CCK-8法检测示，与对照组比较，4个实验组DBM均显示出对MC3T3-E1细胞的促增殖作用，这种效应在共培养1 d后即显著呈现，3 d后A值增幅明显加快且持续至第5天；并且第5天A值从高到低分别为fDBM组>tDBM组>hDBM组>uDBM组>cDBM组，fDBM组A值显著高于其余3个实验组。这一趋势与不同实验组中BMP-2的浓度分布趋势一致，考虑最可能原因是DBM中可释放的BMP-2是促进细胞增殖的关键因子。 

目前关于BMP对细胞增殖影响的研究呈现出截然不同的观点。大部分学者认为BMP可以促进细胞增殖，Han等[15]的研究指出，DBM中胶原纤维作为生长因子的载体主要是BMP的控制释放装置，可以持续刺激周围细胞增殖。Kim等[16]的一项将肝素化壳聚糖作为BMP-2和DBM载体并测定其成骨能力的研究中，发现加入DBM组的细胞在14 d时活力仍然维持90%以上，而不加DBM组的细胞活力下降至85%以下，并且随着DBM加入，细胞增殖潜力以剂量依赖方式增加。然而另有学者通过对MC3T3-E1细胞连续给药重组人BMP-2（0～150 ng/mL）和阿伦膦酸盐（0～15 μmol/L）来比较两种药物的成骨诱导能力，在第1、3、7天采用CCK-8法测定细胞活力，结果显示重组人BMP-2浓度和治疗时间的增加不会影响MC3T3-E1细胞的生存能力[17]。Hughes-Fulford等[18]的研究结果也发现BMP-2可以显著刺激MC3T3-E1细胞矿化相关基因表达，但对与生长相关的基因表达几乎没有影响。更有学者指出，BMP-2可抑制细胞增殖，Yin等[19]在研究miR-35-5p调节成骨细胞分化和钙化中的作用及其特异性分子机制中发现，在BMP-2中培养14 d后，MC3T3-E1细胞的增殖能力反而低于在无BMP-2培养基中的细胞。以上研究结果不一致的一种可能解释是，BMP-2促进细胞增殖的作用可能是一种剂量“微量”和“持续”效应，即只有BMP-2在合适剂量且持续释放并保持这种剂量的前提下，才会促进细胞增殖。DBM作为BMP-2的天然载体可以实现BMP-2的控制性释放，而重组人BMP-2则是典型的爆发式释放，即初始浓度过高，随后浓度急剧下降，这可能是导致不同研究中BMP-2对细胞增殖作用差异的根本因素。

3.3不同BMP-2浓度的DBM对促进细胞成骨分化的影响 

成骨分化是反映DBM成骨性能最被普遍接受的细胞实验指标。成骨细胞表型分化有两个阶段，第一阶段或早期阶段是由细胞外基质的成熟和骨细胞表型基质蛋白（主要是ALP和胶原）的相对表达确定；第二阶段或晚期阶段，细胞外基质由于钙和磷酸盐的沉积而矿化，导致原始软骨周围形成海绵状骨层，形成致密骨[20]。本研究分别对细胞爬片进行了ALP、茜素红和Van Gieson染色来定性观察不同DBM对细胞的成骨分化作用，同时定量测定了共培养14 d时ALP的含量。定性结果显示与对照组相比，4个实验组DBM对细胞分化均有不同促进作用，细胞表达ALP、钙化结节和胶原纤维的程度与DBM中BMP-2的分布浓度趋势一致。既往研究结论也支持本研究结果。Han等[21]发现将DBM与C2C12细胞共培养后诱导的ALP活性呈剂量反应性，与DBM中活性BMP的含量相对应。Sampath等[22]研究表明将BMP-7添加到不同分化阶段富含成骨细胞的培养物中时，会刺激细胞胶原合成。Takuwa等[23]在MC3T3-E1细胞上分别研究了BMP-1、BMP-2和BMP-3对ALP、Ⅰ型胶原和DNA合成的影响，结果表明BMP-2既能刺激ALP生成，也能刺激胶原合成，BMP-3仅能刺激胶原合成，而BMP-1对成骨分化无促进作用。Cheng等[24]用表达BMP的重组腺病毒分别转染C2C12 细胞和C3H10T1/2细胞，21 d后茜素红染色示AdBMP-2、AdBMP-6和AdBMP-9转染的细胞中很容易检测到矿化结节，而在AdBMP-4和AdBMP-7转染的细胞中只能检测到稀疏的矿化结节。这些结果均表明BMP能够促进细胞基质矿化，并且不同成员刺激细胞矿化的作用各不相同。

尽管DBM促细胞分化的能力被大多数学者认可，但是DBM的成骨能力并不是“全或无”的概念，实际上是一种剂量相关效应。在一项研究中，不同浓度DBM植入无胸腺大鼠肌肉内，28 d后显示DBM与种植体矿化之间的线性关系，即100%活性的DBM表现为最大的骨诱导效应，随着植入物中活性DBM的减少，其成骨诱导能力也随之降低，作者将其描述为“比例骨诱导性”[21]。Han等[15]在研究温度和湿度对DBM骨诱导性影响的研究中发现，胶原骨基质作为生长因子的控制释放装置，可以持续刺激细胞分化，DBM释放的骨诱导因子量越大，细胞表达的ALP活性越高。本研究线性回归分析显示，DBM中BMP-2浓度对细胞ALP含量的影响有统计学意义，BMP-2浓度每增加1 ng/g，ALP含量将增加0.017 U/100 mL，表明DBM对细胞的促成骨分化能力与其可释放的BMP-2含量成正相关关系。黄振明等[25]的研究也证实，miR-335-5p mimics可通过上调人BMSCs中BMP-2 mRNA及蛋白表达水平，促进成骨分化，进一步提示miR-335-5p治疗骨质疏松症的作用机制是调控BMP-2的表达。

本研究存在以下不足：为了消除供体因素和制备工艺两个变量，实现样本的同质化处理，研究中限制了DBM的取材量。后期我们会继续选取更多合适供体，以验证BMP在不同骨骼中的分布差异是否具有普遍性。前期研究表明BMP-2作为转化生长因子家族的一员，在骨基质中浓度最大，产生骨诱导的作用最强[18]。因此，本实验初步测定了DBM中BMP-2的浓度，并由此验证了BMP-2浓度与细胞增殖、分化的剂量反应关系。实际上，细胞的增殖和分化是骨基质中多种生长因子共同作用的结果，其他生长因子在某种程度上会影响最终实验结果。但是，本研究揭示的BMP-2在不同骨骼部位的分布特征，为不同骨骼尤其是皮质骨愈合过程和时间方面提供了新的理论基础，具有较好的临床指导意义。

综上述，不同长骨中天然BMP-2的浓度差异较大，下肢长骨高于上肢长骨，BMP-2在不同长骨中的不均衡分布会进一步导致所制备DBM产品之间骨诱导能力的变异。制备DBM时，骨骼取材部位是影响DBM成骨性能的一个重要因素。

参考文献：略

打赏