快报 | 中国人群中 PI3K/AKT/mTOR 通路自噬相关基因多态性与肺结核易感性的关系

作者：何娟，刘盛元，郭旭君，张帆，范玉铮，吴丽娟，Howard Eugene Takiff，赵亚双

第一作者及单位：何娟，哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室/深圳市南山区慢性病防治院结核病防治科

通信作者及单位：赵亚双，哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室

Association of PI3K/AKT/mTOR pathway autophagy-related gene polymorphisms with pulmonary tuberculosis susceptibility in a Chinese population 

He J，Liu S，Guo X，Zhang F，Fan Y，Wu L，Takiff HE，Zhao Y.

Rev Soc Bras Med Trop， 2023，56：e01042023.

doi: 10.1590/0037-8682-0104-2023. eCollection 2023.

PMID: 37493735

1摘要

背景：细胞的自噬过程可以抑制包括结核分枝杆菌（MTB）在内的细胞内微生物的存活，而PI3K/AKT/mTOR通路在其中起着至关重要的作用。本研究探讨了PI3K/AKT/mTOR通路自噬相关基因多态性与肺结核（PTB）易感性之间的关联。

研究方法：在KEGG通路和基因本体（GO）数据库中搜索属于PI3K/AKT/mTOR和自噬通路的基因。在130例肺结核患者和271名对照者中确定了9个基因中的30个SNPs，并检测了它们与肺结核的相关性。我们构建了遗传风险评分（GRS），并根据其GRS将参与者分为3个亚组：0-5、6-10和11-16。

结果：分析结果显示，AKT1（rs12432802）、RPTOR（rs11654508、rs12602885、rs2090204、rs2589144和rs2672897）和TSC2（rs2074969）多态性与PTB风险显著相关。从分析结果中观察到一种递减趋势（P趋势值为0.020），即较低的GRS与较高的PTB风险相关[(6-10)vs.(0-5)：OR（95%CI）0.590（0.374～0.931）；(11-16)vs.(0-5)：OR（95%CI）0.381（0.160～0.906）]。

结论：AKT1、RPTOR和TSC2的多态性可能会影响PTB的易感性。

1研究背景

肺结核（PTB）是一种由结核分枝杆菌（MTB）引起的传染性疾病。世界卫生组织（WHO）的2021年数据显示，全球将新增约1060万肺结核患者。MTB通过空气传播，活动性肺结核患者的密切接触者被感染的风险很高，但大多数患者会发展为潜伏性结核感染（LTBI）。LTBI患者没有结核病的临床症状，全球近四分之一的人口为 LTBI者。这些人中约有5 %~10%的人在晚期免疫系统无法控制潜伏感染时会患上活动性肺结核。因此， LTBI者是新发结核病的储库。数千年来，MTB已经适应了人类宿主，并发展出了颠覆宿主免疫反应、在巨噬细胞内存活和致病的能力。尽管人们对MTB的免疫逃逸机制仍然知之甚少，但宿主的遗传决定因素已被证明在结核病易感性中起着至关重要的作用。 细胞的自噬可以抑制MTB等细胞内微生物的存活，它受各种信号通路的调控。自噬的一个关键调节因子是PI3K/AKT/mTOR通路。mTOR在两个不同的多蛋白复合物mTORC1和mTORC2中发挥作用。PI3K/AKT通路的激活可加速细胞周期的进展并抑制细胞凋亡，从而促进MTB的存活。活化的AKT直接磷酸化并刺激mTORC1，阻断unC-51样自噬激酶（ULK1）复合物的形成，从而阻止自噬体的形成，使MTB得以逃脱宿主细胞的自噬降解。MTB还能通过抑制PI3K/AKT/mTOR途径诱导FoxP3+Tregs增殖和激活，这也是其免疫逃逸的一部分。抑制mTOR通路的药物，如抗癌药物Ibrutinib9和Everolimus10，已被用作辅助性宿主导向疗法（HDT）。因此，通过研究这一途径，可能会发现新的治疗靶点。 基因组学技术可以识别单核苷酸多态性（SNPs），这些单核苷酸多态性是与复杂疾病相关的基因的标记。虽然PI3K/AKT/mTOR通路中的多态性与胃癌和膀胱癌的患病风险增加有关，但很少有研究探讨该通路与结核病易感性的关系。本研究系统筛查了PTB患者PI3K/AKT/mTOR通路自噬相关基因中的SNPs，然后利用病例对照研究评估了这些SNPs与结核病易感性的关系。

1研究方法

401名研究参与者是从2017年5月至2018年7月期间在深圳市南山慢性病防治中心就诊的汉族人群中招募的。该病例对照研究包括痰培养MTB阳性的治疗无效的PTB患者和无结核病临床、放射学或细菌学证据的对照组。对照组使用 γ-干扰素释放试验检测法（IGRA）进行检测，检测结果呈阳性者被视为LTBI。对痰培养阳性者进行对硝基苯甲酸（PNB）检测，排除培养出非结核分枝杆菌的患者。排除了HBV感染、HIV感染、合并慢性阻塞性肺病或癌症的参与者。 伦理审批： 南山区疾控中心伦理审查委员会批准了本研究（ll20170018）。 所有研究参与者均提供了书面知情同意书。   DNA提取： 使用EDTA管采集参与者的血液样本。 使用QIAamp®DNA血液迷你试剂盒提取基因组DNA，提取的DNA用于随后的基因分型。   SNP选择和基因分型： 在京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路数据库中搜索与PI3K/AKT或mTOR通路相关的基因，并将鉴定出的基因归入基因组A（图1）。 此外，还确定了KEGG数据库中与自噬途径相关的基因，并将其与基因本体（GO）数据库中与自噬相关的基因进行比较，以确定两个数据库中的共同基因，并将其归入基因组B。 然后对汇集的基因组 A 和 B 进行比较，以确定两个基因组中存在的基因。   将A和B中共同的基因输入STRING，生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用Cytoscape中的CytoHubba工具确定PPI网络中由12种算法排序的前10个枢纽基因。枢纽基因被定义为在候选模块中具有高度相关性的基因。在这组枢纽基因中，至少有六种算法识别出的基因被包括在内。 所选基因的标记SNPs是使用HaploView 4.2从1000基因组计划中获得的。然后，我们选择了小等位基因频率（MAF）≥0.05、哈代-温伯格平衡（HWE）检验 P>0.05的SNPs。研究人员选择了具有预测功能的基因中的SNPs以及以前在文献中报道过的SNPs。基因分型使用Illumina Human Omni Zhong Hua-8 Bead Chip进行。选择5%的样本进行重复分析。 统计分析： 年龄和性别比较分别采用t检验和卡方检验。 使用R（4.0.3版）中的SNPassoc软件包评估了对照组的HWE。 应用遗传模型（共显性、显性和隐性）评估遗传变异对PTB风险的影响。 遗传风险评分（GRS）是通过将PTB相关SNP的风险等位基因数（0、1或2）相加计算得出的。 应用广义多因素降维法（GMDR）研究SNP-SNP相互作用。 年龄和性别作为交互作用分析的协变量。 基因分型数据使用Genome Studio （2.0版）和Plink （1.90版）处理。 统计分析使用IBM SPSS Statistics（22.0版）。  

1研究结果

我们纳入了130例肺结核患者和271名对照者，他们的平均年龄分别为（31.18±10.85）和（36.52±12.83）岁。对照组分为两组：163名健康对照组（HC）和108名结核分枝杆菌潜伏感染患者。肺结核患者的年龄分布与对照组有明显差异（ P<0.05），15 ～ 29岁年龄组的肺结核患者多于健康对照组或LTBI组，40～89岁年龄组的肺结核患者少于健康对照组或LTBI组。 这表明，MTB更容易在中青年人群中致病。 性别分布无明显差异（表1）。

通过筛选PI3K/AKT/mTOR通路中的自噬相关基因，确定了50个基因，并将其引入STRING以生成PPI网络（图1）。筛选出了9个枢纽基因（AKT1、AKT2、mTOR、PIK3CA、PTEN、RHEB、RPS6KB1、RPTOR和TSC2），并分析了这些基因中发现的30个SNP与PTB易感性的关联。在PTB组和对照组中，RPTOR基因中的rs11654508、rs2090204、rs2589144、rs2672897和rs7503807SNP以及TSC2基因中的rs2074969SNP的等位基因频率分布有显著差异（ P=0.016、0.038、0.001、0.001、0.044和0.015，使用卡方检验）（表1）。在对照组中，所有选定SNP的等位基因频率均未偏离HWE（ P<0.05）。

在30个SNPs中，AKT1中的1个（rs12432802）、RPTOR中的5个（rs11654508、rs12602885、rs2589144、rs2672897和rs7503807）和TSC2中的1个（rs2074969）在遗传模型中与PTB风险相关（ P＜0.05）（表2）。其余23个SNP的频率差异不大（ P>0.05）（表2）。

就AKT1基因而言，rs12432802的GA基因型在PTB组中的发病率低于对照组（GA vs. AA： OR（95% CI）0.560（0.323～0.970）； P=0.038）。同样，TSC2rs2074969多态性与PTB的风险降低有关，在共显性模型（AG vs. GG： OR（95% CI）0.442（0.253～0.771）； P=0.004）和显性模型（AG+AAvs.GG：OR（95% CI）0.424（0.249～0.719）； P=0.001）中都是如此。就RPTORrs12602885多态性而言，在显性模型中，与携带GG基因型的受试者相比，AA+AG基因型的受试者患PTB的风险相对较低（AG+AA vs. GG： OR（95% CI）0.611（0.380～0.981）； P=0.041）。此外，在共显性模型中，RPTORrs2589144、rs2672897和rs7503807多态性与PTB风险显著降低相关（表2）。在显性模型中，rs2589144多态性（AA+AG vs. GG： OR（95% CI）0.527（0.318～0.873）； P=0.013）和在隐性模型中，rs2672897多态性（GG vs. AA+GA：或（95% CI）0.410（0.210～0.800）； P=0.009）。相反，RPTORrs11654508多态性在显性（GG vs. AA： OR（95% CI）2.116（1.101～4.068）； P=0.025）和隐性模型（GG vs. AA+GA： OR（95% CI）2.001（1.110～3.605）； P=0.021）。 在比较LTBI组和PTB组时，我们还发现PTB风险与RPTOR（rs10871489、rs2090204、rs2589144和rs2672897）和TSC2（rs2074969）中的SNPs有显著关联（ P＜0.05）（表3）。对于RPTOR（rs10871489、rs2090204和rs2589144）和TSC2（rs2074969）多态性，Mm基因型在共显性模型的PTB患者中明显较少（Mm vs. MM：rs10871489， OR（95% CI）0.535（0.295～0.970）， P=0.039；rs2090204， OR（95% CI）0.465（0.252～0.858）， P=0.014；rs2589144， OR（95% CI）0.541（0.293～0.998）， P=0.049；rs2074969， OR（95% CI）0.499（0.260～0.958）， P=0.037），显性模型也是如此。此外，当PTB组与LTBI组比较时，在显性模型中，RPTORrs2672897多态性与PTB风险降低相关（GA+GG vs. AA： OR（95%CI）0.539（0.302～0.963）； P=0.037）。

我们比较了HC组和LTBI组，发现只有AKT1（rs11848899）和RHEB（rs3789817）与LTBI风险降低有关（表4）。就AKT1rs11848899多态性而言，LTBI组中AC基因型（AC vs. CC： OR（95% CI）0.558（0.318～0.979）； P=0.042）和AC+AA基因型（AC+AA vs. CC： OR（95% CI）0.539（0.312～0.931）； P=0.027）的频率明显低于CC基因型。在RHEBrs3789817多态性中，LTBI组中AG+AA基因型也明显少于HC组。 在计算GRS时，纳入了11个具有明显组间频率差异的SNP（AKT：rs12432802和rs11848899；RHEB：rs3789817；RPTOR：rs11654508、rs12602885、rs2589144、rs2672897、rs2090204、rs10871489和rs7503807；TSC2：rs2074969）。单个遗传风险评分从最低0到最高16分不等，合并成0-5、6-10和11-16三个亚组（表4）。PTB组的平均GRS低于对照组（平均GRS：5.88vs.6.94， P<0.001），且有正向趋势（ P趋势=0.020）。与GRS值为0-5的个体相比，GRS值越高的个体患PTB的可能性越小（GRS值为6-10的个体， OR值（95% CI）为0.590（0.374～0.931）， P=0.023；GRS值为11-16的个体， OR值（95% CI）为0.381（0.160～0.906）， P=0.029）。

我们继而分析了SNP-SNP与作为GMDR结果的PTB诊断与否的交互作用。在交互作用模型中，只有一个SNP（rs11848899）存在显著差异（ P=0.0107），测试准确率为50.45%（表5）。在两个或两个以上SNP的交互作用模型中没有发现明显差异。

1研究结论

本研究调查了中国汉族人群中PI3K/AKT/mTOR通路自噬相关基因中的30个SNPs与PTB风险的关系。结果显示，AKT1（rs12432802）、RPTOR（rs12602885、rs2589144、rs2672897、rs7503807）和TSC2（rs2074969）多态性与PTB患病风险显著降低相关，而RPTOR（rs11654508）多态性与PTB患病风险显著升高相关。同时，根据本研究中发现的重要SNPs，较低的GRS与较高的PTB风险相关。 在本研究中，确定AKT1、RPTOR和TSC2为枢纽基因。AKT1的活化有助于巨噬细胞转变为替代活化表型（M2）。宿主巨噬细胞从经典活化表型（M1）过渡到M2表型是MTB避开敌对环境的一种方式。在五个AKT1SNPs中，AKT1rs12432802多态性与PTB风险降低相关，而rs11848899多态性在LTBI组中更为常见，而在已发表的文献中发现与两个SNPs的研究。Wang等人发现AKT1rs3730358和rs1130233多态性与PTB易感性相关，但在我们的研究中，rs1130233的PTB相关性未得到证实，这可能是由于中国北方和南方汉族人群等位基因频率的差异或这两项研究的样本量不足所致。在肺癌和胃癌患者中，AKT1多态性与临床结果相关；但另一项研究发现，AKT1多态性很少见，对膀胱癌治疗没有生物标志物价值。 在免疫或感染过程中，RPTOR参与启动T滤泡调节细胞分化，RPTOR基因的低甲基化被认为与涉及胸膜的结核病有关。在本研究所涉及的10个RPTORSNPs中，有5个（rs12602885、rs2589144、rs2672897、rs7503807和rs11654508）与结核病风险显著相关。rs12602885多态性与癌症风险的关系已被广泛研究；然而，一项荟萃分析发现，在中国人群中，rs12602885多态性与癌症没有关系。rs12602885多态性与PTB患病风险降低的关系此前尚未见报道。RPTOR基因的多态性与胰腺癌和肥胖症风险的增加有关，但这些关联的研究结果相互矛盾，没有定论。 TSC2（结节性硬化症2）基因对维持巨噬细胞静止状态至关重要，可通过依赖于mTOR的通路防止肉芽肿疾病的发生。MTB感染通常会在肺部引起肉芽肿，肉芽肿的早期形成被认为有利于LTBI而非PTB的发展。我们发现，与LTBI组相比，TSC2rs2074969多态性与PTB易感性降低有关。然而，当将LTBI组与HC组进行比较时，两者的相关性并不显著。与之前利用敲除TSC2基因的小鼠进行的研究相似，作者认为TSC2可能参与了结核病的发展，因此TSC2多态性可作为疾病进展的生物标志物之一。据报道，TSC1和TSC2基因突变是结节性硬化性综合征的遗传基础，TSC2基因变异与中国儿童的癫痫状态有关。 脑内富集的Ras同源物（RHEB）是microRNA-155的靶基因，可降低巨噬细胞内分枝杆菌的存活率。与HC组相比，RHEB基因多态性可能与MTB感染易感性有关，但与PTB组相比则无关。RHEBrs1109089多态性与印度东北部一个历史上高风险的孤立人群的自杀有关；然而，其他已发表的研究中有关RHEB基因多态性的研究较少。 与对照组相比，使用基于具有统计学意义的SNPs的简单GRS，我们发现较低的GRS分数与PTB的风险的增加有关，但GRS分数与LTBI没有关联。我们的GMDR分析显示，11个明显相关的SNP之间没有明显的相互作用，最高的测试准确率为50.45%。然而，未能发现相互作用可能是由于所研究的基因位点数量有限且样本量相对较小。 这项研究存在一些局限性。首先，我们只纳入了南山汉族人口，参与者的数量可能不足以检测到微小的影响或作用。因此，所发现的关联应在涉及不同种族的更大规模的研究中得到证实。其次，健康对照组采用IGRA而非Mantoux结核菌素皮肤试验（TST）来评估是否患有LTBI。虽然IGRA和TST都是世界卫生组织推荐的方法，但我们采用了IGRA，因为所有参与者都接种了卡介苗（BCG）。第三，只确定了有限数量的SNPs。PI3K/AKT/mTOR通路在PTB病理学中的关键作用表明，对该通路中其他风险位点和单倍型的鉴定研究是值得的。 总之，这项针对深圳南山汉族人群的PTB和对照组研究发现，PTB的发病风险与PI3K/AKT/mTOR通路相关基因的多态性之间存在显著关联。根据编码蛋白的已知功能，我们认为AKT1、RPTOR和TSC2的多态性可能会通过改变自噬介导的对MTB的免疫反应而改变对PTB的易感性。此外，GRS的降低与PTB风险的增加有关。要证实这些关联，还需要进行样本量更大、种族更多样化的研究。

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编辑：王然

审校：郭萌

发布日期：2023-08-31

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