科研丨J PATHOL: 肠道白色念珠菌过度生长加剧了博莱霉素诱导的微生态失调小鼠肺纤维化

编译：微科盟郝恬，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读   越来越多的证据表明，肠道微生物群与远端器官疾病之间存在相互作用。然而，肺纤维化与肠道菌群，特别是肠道真菌菌群之间的关系尚不清楚。因此，本研究旨在确定肠道真菌菌群的变化对肺纤维化发病机制的影响。通过口服抗生素和白色念珠菌建立了肠道白色念珠菌过度生长的小鼠，与对照小鼠(没有白色念珠菌干预)相比，博莱霉素诱导的肺纤维化加速。此外，肠道白色念珠菌过度生长的小鼠表现出Th17型免疫增强，用IL-17A中和抗体治疗缓解了这些小鼠的肺纤维化，但对照小鼠没有。这一结果表明IL-17A参与白色念珠菌加剧肺纤维化的发病机制。在博莱霉素治疗之前，Th17的主要调节因子Rorc在肠道白色念珠菌过度生长小鼠的肺淋巴细胞中的表达就已经上调，随后博莱霉素触发这些Th17淋巴细胞产生IL-17A，从而增强内皮-间质转化。这些结果表明，肠道白色念珠菌的过度生长通过IL-17A介导的内皮-间质转化加剧了肺纤维化。因此，它可能是肺纤维化的潜在治疗靶点。本研究可能为利用肠道真菌菌群作为肺纤维化治疗的新靶点奠定基础。    

论文ID

原名：Intestinal overgrowth of Candida albicans exacerbates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice with dysbiosis

译名：肠道白色念珠菌过度生长加剧了博莱霉素诱导的微生态失调小鼠肺纤维化

期刊：The Journal of Pathology

IF：7.3

发表时间：2023.8.11

通讯作者：Taku Nakashima

通讯作者单位：日本广岛大学

DOI号：10.1002/path.6169

实验设计

结果

1 肠道白色念珠菌增殖加剧肺纤维化

模拟人类肠道白色念珠菌繁殖需要肠道微生态失调，我们从BLM给药前1周开始给干预组小鼠饮用含有抗生素和外源性白色念珠菌的水，直到小鼠被处死(Candida+组)。相反，对照组小鼠在同一时期内饮用含有抗生素和抗真菌药物(FLCZ)的水，以消除原有生物(Candida-组)(图1A)。Candida+组小鼠肠道未显示炎症细胞浸润，但在粘膜固有层中发现PAS阳性酵母真菌，表明白色念珠菌定殖(图1B，补充材料图S1A，B)。本研究观察到Candida+组粪便中白色念珠菌增加，而Candida-组没有(图1C)。在两组的BALF或肺匀浆中均未检测到白色念珠菌(数据未显示)。

为了阐明肠道白色念珠菌增殖对肺纤维化的影响，我们比较了羟脯氨酸水平(肺胶原含量推荐指标)和组织学结果(图1D-F)。研究证实，当使用PBS代替BLM时，没有发现纤维化(补充材料图S2)。如先前的报告所示，抗生素治疗抑制了肺纤维化(图1D-F: DW vs. Candida-)。肠道白色念珠菌的过度生长部分逆转了抗生素的抗纤维化作用(图1D-F：Candida- vs. Candida+)。Candida+组小鼠的肺纤维化严重程度明显高于Candida-组小鼠。BALF细胞组分比较显示，Candida+组中性粒细胞呈非显著增加的趋势(补充材料图S3)。为了排除FLCZ影响肺纤维化严重程度的可能性，作者证实了单独使用FLCZ不影响羟脯氨酸水平(补充材料图S4)。

图1 肠道念珠菌增殖加剧肺纤维化。(A)抗菌药物处理、真菌给药和诱导肺纤维化的实验方案和组名。BLM，博莱霉素；CPZ，头孢哌酮；CLDM，克林霉素；DW，蒸馏水；FLCZ，氟康唑。(B) Candida-和Candida+组小鼠盲肠组织切片过碘酸-雪夫染色。红色箭头：固有层念珠菌。(C)粪便在CHROMagar培养基上培养48小时。绿色菌落：白色念珠菌生长。Candida+组中可见菌落(中间)，但在Candida-组没有(左侧)，各组白色念珠菌CFU的比较(n=8-11/组)(右)。(D)各组肺羟脯氨酸含量(n=4-5/组)。(E)各组肺组织切片Masson三色染色组织学分析。(F)通过Ashcroft评分对纤维化进行量化(n=5/组)。

2 肠道和肺部微生物群分析

为了评估抗菌药物、抗真菌药物和BLM给药引起的变化，我们用从这些组获得的样本分析了肠道和肺部微生物群。从样本中提取DNA分析真菌微生物群，结果显示，在Candida+组小鼠的粪便样本中检测到的真菌均为念珠菌，包括白色念珠菌。相比之下，Candida-组小鼠的粪便样本中很少检测到念珠菌属物种(Candidaspp.)，并且鉴定出多种真菌，包括酵母属物种(Saccharomycesspp.)(图2A、B和补充材料图S5A)。尽管在两组小鼠的BALF和肺部样本中都发现了念珠菌，但其占比没有显著差异(图2C–F和补充材料S5B，C)。细菌微生物群测序分析显示，Candida-和Candida+组小鼠的粪便样本中存在厚壁菌门(Firmicutes spp.)和变形菌门(Proteobacteria spp.)物种，并且两组之间这些物种的丰度没有显著差异(补充材料图S6A)。大多数细菌在BALF和肺部难以识别，没有观察到特别的差异(补充材料图S6B，C)。

图2 真菌微生物群分析。(A、C和E)利用ITS测序分析Candida-和Candida+组小鼠粪便(A)、BALF(C)和肺(E)样本中真菌菌属的分类分布。每组四个代表性样本。(B、D和F)每组粪便(B)、BALF(D)和肺(F)样本中念珠菌属ITS转录本的百分比(n=5-8/组)。  

3 白色念珠菌加重肺纤维化由Th17(IL-17A)介导

通过流式细胞术分析了肺细胞组分，以确定导致Candida+组肺纤维化加重的细胞类型(补充材料图S7A，B)。M2巨噬细胞(CD45+/F4/80+/CD11c+/CD206+)或Treg(CD3+/CD4+/CD25+)组分在两组之间没有差异，而Candida+组中Th17(CD3+/CD4+/IL-17A+)显著升高(图3A)。此外，肺羟脯氨酸含量与Th17呈正相关(补充材料图S8)。同样，肺组织RT-qPCR(图3B)及血清和肺组织ELISA(图3C)结果显示，Candida+组小鼠中编码Th17细胞因子IL-17A(Il17a)的mRNA表达显著高于Candida-组。本研究发现，Th1和Th2的主要调节因子Tbx21和Gata3的表达没有差异(补充材料图S9A)。TGF-β(Tgfb)是促纤维化的关键介质之一，其在两组之间也没有差异(补充材料图S9B，C)。基于这些结果，我们假设Th17/IL-17A是导致两组间肺纤维化差异的主要原因。为了验证这一假设，我们使用抗IL-17A中和抗体来中和IL-17A(补充材料图S10)。在粪便培养中，无论使用何种中和抗体，念珠菌定殖都没有明显差异(补充材料图S11)。然而，结果显示，给予IL-17A中和抗体显著降低了Candida+组小鼠的羟脯氨酸水平和病理特征，而Candida-组小鼠并没有(图3D-F)，表明Candida+组小鼠的纤维化恶化是由IL-17A介导的。

为了证实Th17的诱导是否与肠道白色念珠菌增殖有关，我们评估了在其他环境下BLM干预14天后肠道白色念珠菌检测与肺Th17诱导之间的关系。比较了只饮用蒸馏水的小鼠(DW组)和饮用不含抗生素但含白色念珠菌水的小鼠(C. albicans w/o ABx组)肺纤维化(补充材料图S12A)。在C. albicans w/o ABx组中，白色念珠菌菌落形成不大，但在粪便培养中可以检测到，与DW组相比，肺部Th17显著增加(补充材料图S12B，C)。然而，两组之间的羟脯氨酸水平没有差异(补充材料图S12D)。当给小鼠饮用含有抗生素不含白色念珠菌的水时，在一些小鼠粪便中检测到了白色念珠菌，如补充材料图S13A所示，并且这些小鼠的肺部Th17水平趋于增加(补充材料图S13B)。

图3 IL-17A介导肺纤维化加重。(A) M2巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的流式细胞术分析。肺细胞在博莱霉素给药14天后获得(n=4-5/组)。(B) RT-qPCR分析BLM给药14天后肺组织中Il17amRNA表达水平。数值表示相对于18S mRNA的表达(n=4-5/组)。(C) BLM给药14天后血清和肺中IL-17A水平(n=4-5/组)。(D)使用或不使用IL-17A中和抗体的各组的肺羟脯氨酸含量(n=6-12/组)。(E)使用Masson三色染色对各组肺组织切片进行组织学分析。(F)通过Ashcroft评分对纤维化进行量化(n=5-6/组)。(G)流式细胞术分析BLM给药前小鼠肺细胞中Th17的百分比(n=5/组)。(H)流式细胞术分析BLM给药前或给药后14天小鼠血细胞中Th17的百分比(n=4-5/组)。(I) RT-qPCR分析Rorc和Il17a mRNA表达水平。(J) BLM给药前小鼠盲肠RORγt免疫染色的代表性图像。

4 肠道白色念珠菌过度生长诱导肺部Th17的机制

作者研究了肠道白色念珠菌过度生长促进肺部Th17的机制。BLM给药前肺细胞的流式细胞术分析未显示Th17(CD3+/CD4+/IL-17A+)细胞数量增加(图3G)。在血液或BALF培养物中未检测到白色念珠菌(数据未显示)，这排除了白色念珠菌迁移到肺部的可能性。本研究还探讨了肠道中转化为Th17的淋巴细胞通过血液迁移到肺部的可能性，但流式细胞术结果显示，在BLM给药前或给药后获得的血液中没有IL-17A+细胞(图3H)。之后作者评估了Th17的主要调节因子RORγt(Rorc)。在BLM给药前对肺CD4+淋巴细胞(CD3+/CD4+)进行分选，提取RNA，并进行RT-qPCR。尽管这两组小鼠的Il17a mRNA表达没有差异，但Candida+组小鼠的Rorc mRNA表达显著高于Candida-组(图3I)。为了确定表达RORγt细胞的来源，对BLM给药前的小鼠盲肠组织进行免疫组织化学染色。结果显示，RORγt阳性细胞仅在Candida+组中发现(图3J)。

5 EMT参与IL-17A介导的肺纤维化加剧

作者进一步研究了IL-17A加剧肺纤维化的机制。据报道，IL-17A通过动员中性粒细胞、诱导炎性细胞因子、促进EMT、激活成纤维细胞加剧肺纤维化。为了研究这些现象是否在本模型中发生，我们对BLM给药7天的小鼠的肺细胞进行流式细胞术分析(补充材料图S14A-C)。在Candida+组中，表达上皮标志物的细胞数量减少，而共表达间充质标志物的上皮细胞数量有增加的趋势，表明发生了上皮损伤和EMT(图4A)。同样，αSMA+/Col1A1+成纤维细胞数量增加，表明成纤维母细胞转化为肌成纤维细胞，即成纤维细胞的活化形式(图4B)。此外，内皮细胞数量减少，而共表达间充质标志物的内皮细胞数量增加，表明发生了内皮损伤和内皮-间充质转化(EndMT)(图4C)。此外，当用抗IL-17A中和抗体处理小鼠时，EndMT受到抑制(图4D)。为了证实这种EndMT是否由IL-17A引起，我们在补充了不同浓度IL-17A的培养基中培养小鼠内皮细胞系MS1。RT-qPCR分析结果显示，在用IL-17A培养的细胞中，间充质标志物(Fn、Col1a1和Acta2)和EndMT标志物(Snail1和Snail2)的mRNA表达增加(图4E)。流式细胞术显示，补充IL-17A降低了内皮标志物的表达，但增加了EndMT标志物的表达(图4F)。此外，免疫荧光细胞化学显示，在用IL-17A培养的MS1细胞中，αSMA和Col1a1蛋白的表达上调(图4G，H)，这表明IL-17A不仅可以通过促进EMT和激活成纤维细胞来加剧肺纤维化，还可以通过诱导EndMT来实现。图5总结了当前研究的结果。

图4 (A)上皮细胞(CD45-/CD31-中EpCAM+)和上皮细胞EMT(EpCAM+/CD45-/CD31-中αSMA+/Col1a1+)的百分比。(B)活化成纤维细胞(肌成纤维细胞：EpCAM-/CD45-/CD31-中αSMA+/Col1a1+)的百分比。(C)内皮细胞(CD45-/CD31+)和内皮细胞EMT(在CD45-/CD31+中αSMA+/Col1a1+)的百分比。(D)用同种型对照抗体或抗IL-17A抗体处理的小鼠中内皮细胞EMT的百分比(n=6-7/组)。(E) RT-qPCR分析在限定条件下培养的MS1细胞中间充质标志物(Fn，Col1a1，Acta2)和EMT标志物(Snail1和Snail2)的mRNA表达水平。(F)流式细胞术分析MS1细胞中CD31的表达(下)和CD31+MS1细胞中αSMA+/Col1a1+的表达(上)。(G) MS1免疫荧光细胞化学代表性图像。将细胞在含有或不含有IL-17A的培养基中孵育30小时。显示了αSMA(红色)、Col1a1(绿色)和nuclei (蓝色)的表达水平。(H)各组荧光强度的比较(n=6-11/组)。

图5 本研究的图文摘要。  

讨论

微生物群的变化不仅与胃肠道疾病有关，还与包括肺在内的各种器官的疾病有关。关于肺纤维化，BALF中较高的细菌负荷与IPF患者预后不良相关，肺微生物群的去除可抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化。然而，肠道微生物群(尤其是真菌菌群)在肺纤维化病理生理中的作用尚不清楚。此外，一项涉及IPF患者服用抗生素的临床试验未能改善其预后。在人体中，抗生素的使用会导致粪便中的酵母菌生长，而包括念珠菌在内的肠道酵母菌的生长可能会加剧肺纤维化，正如在本研究中所显示的那样。为了实现IPF的微生物靶向治疗，进一步的研究不仅需要消除特定的细菌，还需要考虑肠道微生态失调，特别是抗生素引起的真菌菌群的变化，包括白色念珠菌。肠道和真菌菌群的影响值得进一步研究。

肠道微生物群的变化会影响各种病理生理状况，例如抗癌化疗的疗效。一些研究报告了微生物群相关的T细胞表型和细胞因子产生的变化；然而，肠道微生物群影响远端器官的确切机制尚未完全阐明。在过敏性气管炎小鼠模型中，肠道念珠菌过度生长及其产生的因子(如前列腺素)导致肺M2巨噬细胞的激活，这在当前模型中没有观察到。同样，未观察到Th1、Th2或TGF-β的变化(补充材料图S9A-C)。

相反，在诱导肺纤维化之前，盲肠和肺中表达RORγt(Rorc)的Th17淋巴细胞增加。本研究的结果表明，肠道白色念珠菌的增殖导致表达Rorc的Th17淋巴细胞到达远端器官(包括肺)，BLM刺激这些细胞产生IL-17A。研究表明，在哮喘和COPD患者的外周血以及囊性纤维化患者的肺中，白色念珠菌反应性T细胞通过与其他真菌的交叉反应参与IL-17A表达的增加。因此，肠道白色念珠菌增殖诱导肺中IL-17A的表达不是纤维化特异性的，可能是多种疾病的共同机制。在本研究中，我们比较了抗生素+白色念珠菌(Candida+组)和抗生素+FLCZ(Candida-组)，发现除白色念珠菌外的其他因素，特别是FLCZ给药或其他特定真菌(如酵母菌)的减少都可能会影响Th17淋巴细胞的诱导。然而，除了报道的白色念珠菌与Th17之间的关联外，在饮用不含抗生素但含白色念珠菌的水的小鼠中发现了更多产生IL-17A的细胞(图S12C)。

此外，本研究小鼠有内源性白色念珠菌，即使饮用仅含抗生素的水，我们偶尔也会检测到白色念珠菌(补充材料图S13A)。在粪便培养物中检测到白色念珠菌的小鼠往往比未检测到白色念珠菌的小鼠诱导更多的Th17(补充材料图S13B)。这些结果表明，白色念珠菌有助于诱导Th17淋巴细胞。 IL-17A与肺纤维化恶化有关。已报道的机制包括通过G-CSF诱导促进中性粒细胞动员、产生趋化因子、诱导肺泡上皮细胞EMT、刺激成纤维细胞以及抑制自噬。当前模型中BALF的分选细胞在Candida+组的中性粒细胞中显示出不显著但增加的趋势(补充材料图S3)。这种中性粒细胞倾向可能是由IL-17A的增加引起的，这可能有助于加剧纤维化。除了这些已知的机制外，我们还发现IL-17A可以在体外和体内诱导EndMT。大量研究表明，EndMT可以加剧肺纤维化，这表明该途径也可能是一个有前景的治疗靶点。IL-17A通过多种途径参与肺纤维化的发病机制，IL-17A抑制剂已在临床上用于治疗自身免疫性疾病，如银屑病。在肺纤维化患者中，抑制17型免疫尚未确定疗效，但这种策略可能对某些人群有效。

如补充材料图S12D所示，饮水中含有白色念珠菌但不含抗生素的小鼠肺纤维化没有恶化的原因尚不清楚。C. albicans w/o ABx组(补充材料图S12C)中CD3+/CD4+/IL-17A+细胞的百分比与Candida+组相同(图3A)，表明共生菌可以抵消Th17的影响。白色念珠菌的增殖和共生菌群的生态失调似乎是白色念珠菌在肺纤维化中发挥其毒力所必需的。对抗白色念珠菌的特定共生菌值得进一步分析。 综上所述，本研究表明，肠道白色念珠菌的增殖通过将Th17细胞动员到肺部，并增强这些被动员细胞产生IL-17A，从而加剧肺纤维化。这种反应由逐步机制调节，其中白色念珠菌在肠道中的增殖首先导致表达Rorc的细胞向远端器官循环，然后由局部刺激物(如BLM)触发表达Rorc细胞的激活。

此外，IL-17A除了先前报道的促进EMT和成纤维细胞激活的作用外，还通过诱导EndMT加剧纤维化。这些发现有助于阐明肠道和真菌菌群作为肺纤维化治疗靶点的重要性。

打赏