快报 | WGS用于检测耐药肺外结核MTB突变位点的研究

Whole genome sequencing of drug resistance Mycobacterium tuberculosis from extra-pulmonary sites.

Shi T, Shou F, He Y, Zhou K, Gao W, Nie X, Han M, Liao C, Li T.

Life Sci Alliance, 2023, 6(11):e202302076.

doi: 10.26508/lsa.202302076.

PMID: 37591723.

近日，Life Science Alliance杂志发表了重庆市公共卫生医疗救治中心关于WGS用于检测耐药肺外结核（DR-EPTB）MTB突变位点的回顾性研究（Whole genome sequencing of drug resistance Mycobacterium tuberculosis from extra-pulmonary sites）。本研究分析了2020年1月至2021年12月经WGS检测的多种类型DR-EPTB患者标本，共计111例。WGS检测DR-EPTB具有较高的敏感度和特异度，能够明确突变位点、耐药种类及耐药菌株的传播趋势。根据实验结果，研究者认为在中国西南部地区的异烟肼（INH）、利福平（RFP）和链霉素（Sm）是EPTB主要的耐药药物，katG_p.Ser315, rpoB_p.Ser450Leu和rpsL_p.Lys43Arg是主要的基因突变位点，患者耐药种类和居住地是其近期传播的风险因素。天津市第一中心医院石涛为本文的第一作者，重庆市公共卫生医疗救治中心中心实验室李同心和廖传玉为本文的通信作者。

结核病是由结核分枝杆菌引起的对人类健康有威胁的疾病，结核分枝杆菌可影响肺部和其他肺外部位。2018年，估计有1000万例患有结核病，在HIV阴性人群中有120万例死于结核病，HIV阳性人群中有25.1万例死于结核病。在全球范围内，大约有1/4的人口感染了结核分枝杆菌，2019年估计有1000（890～1100）万例罹患结核病。中国是结核病高负担国家，占全球总数量的8.4%（世界卫生组织，2020年）。EPTB是结核病的一种常见疾病，其发病部位包括淋巴结、泌尿生殖系统、中枢神经系统、胃肠道、胸膜、骨骼和关节、皮肤和心包。在EPTB中，基因突变位点导致的DR-EPTB传播有可能进一步加重结核病的扩散。本研究利用全基因组测序（WGS）技术分析EPTB患者耐药结核分枝杆菌，确定DR-EPTB的突变特征和传播。

研究对象

纳入2020年1月至2021年12在重庆市公共卫生医疗中心入院诊治的EPTB患者，这些患者主要来自重庆市及邻近的四川和贵州等省份。由临床医生无菌采集所有入组患者除尿液和粪便外的标本，所有患者血清学检测均为HIV抗体阴性。结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）来自中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室。

研究方法

1.实验方法：在外科手术或操作中收集实验所需样本。所有标本采集、分枝杆菌培养、比例法药物敏感性试验均按照中国防痨协会编写的《结核病诊断细菌学检验规程》进行。其中分枝杆菌培养采用基于MACTEC MGIT960系统的MGIT 960培养管和改良罗氏培养基同时培养。分离培养阳性菌株DNA提取方法采用CTAB方法，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序。

2.统计学处理：所有数据均以“均数±标准差”或“例（百分率，%）”描述。不同性状与不同基因型间的差异比较采用卡方检验。采用BioNumerics 5.0应用数学（applied mathematics）方法构建基于WGS数据的最小生成树。采用平均连杆法和MEGA 6.0软件包非加权对群法构建树图。不同谱系和聚类间不同性状的差异比较采用单变量分析。采用多因素logistic回归模型分析所有特征。以P<0.05为差异有统计学意义。

研究结果

一、研究人群的特征

共收集到111例患者的111份标本。其中，男性占63.1%，女性占36.9%。111份样本的详细信息见表1。111例患者居住地信息见图1～3。图4为重庆、四川及贵州毗邻区域图。表2显示每个区域患者例数。

二、表型耐药和基因型耐药情况

111份样本中，准广泛耐药结核病（Pre-XDR-TB）样本占53.2%，耐多药结核病（MDR-TB）占29.7%，多耐药结核病（poly-DR-TB）占12.6%（图5）。poly-DR-TB样本耐药类型见图6。

在111株结核分枝杆菌中，有5份样本为异烟肼耐药结核病（hr-TB）。异烟肼、利福平和利福喷丁是耐药种类最多的3类药物，卷曲霉素最少。在基因型耐药检测中，发现有4株为基因敏感型菌株（图7），其中2株是表型MDR-TB，1株为hr-TB，1株为poly-DR-TB。

三、WGS结果

111株菌株的系统进化树详见图7。98株是东亚型（lineage 2），其余是欧美型（lineage 4）。总计有32个簇和50个独立型，成簇率为55%，成簇比率为39%。

四、基因突变位点 

111株菌株中，90株含利福平突变位点、101株含异烟肼突变位点，61株含吡嗪酰胺（PZA）突变位点、79株含乙胺丁醇（EMB）突变位点、87株含链霉素（Sm）突变位点、59株含氟喹诺酮类（FQ）突变位点、15株含氨基糖苷类突变位点、44株含乙硫异烟胺（Eto）突变位点、16株含对氨基水杨酸（PAS）突变位点。表3显示不同药物突变位点的菌株数目，表4显示耐药突变位点只有1株菌株的情况。

五、基因突变与患者居住区域的相关性分析

总计有7个区域患者数超过5例，其中彭水、忠县和达州排名前三。表5显示来源于该区域的菌株突变位点。在上述7个区域中患者占比52.3%。不同突变位点的数目见表5。

六、DR-EPTB的区域性传播

使用单因素分析DR-EPTB传播风险。结果显示，居住地、表型耐药均与疾病传播有明显相关性（表6）。多因素分析显示：性别、年龄、居住地、患者类型、耐药类型和患者居住区域是疾病传播的相关风险因素（表7）。MDR-TB和poly-DR-TB是感染lineage 2菌株的风险因素。在lineage和成簇间无相关性（表8）。

七、典型区域患者分析

彭水是此次研究发病例数最多的区域。总计18例患者，其中9例患者居住在同一街道和村镇（图8），其他9例患者居住在相邻的村镇，分析这些患者感染的菌株，相关性见图8。

Figure 8 Phyletic evolution of strains from Pengshui County of Chongqing City

意义与展望

WGS作为对耐药结核分枝杆菌检测的研究目前多用于实验室阶段，但是随着WGS成本的降低，此方法以后可能用于对常规患者感染结核分枝杆菌的常规检验，该方法的优势在于能够明确突变位点，为治疗方案提出更加精准的依据，同时WGS可以对耐药做出进一步的预测，明确耐药菌株传播情况，监测菌株的积累突变等。

对于目前我国局部地区结核病高发的情况，迫切需要我们提高检测技术手段，从而更好地控制结核病的传播，制定更加精准的治疗方案，做出更加严密的预防措施，以便更好地保护广大人民群众的身体健康。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：李同心

编辑：孟莉

审校：范永德

发布日期：2023-08-28

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