科研丨台北医大附设医院: 鼻内给药约氏乳杆菌通过调节新生小鼠肠道微生物群减轻高氧诱导的肺损伤(国人佳作)

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

辅助供氧会损害呼吸窘迫新生儿的肺发育。补充约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)可减轻小鼠呼吸道病毒感染，并具有抗炎作用。本研究探讨了经鼻给药约氏乳杆菌对高氧暴露新生小鼠肺发育的保护作用。新生C57BL/6N小鼠分别在室内空气(RA)或高氧(85% O2)条件下饲养。从出生后第0天到第6天，新生小鼠中以1×105CFU剂量给药10 μL L. johnsonii。对照小鼠接受等量生理盐水(NS)。本研究评估了以下四个研究组：RA+NS、RA+益生菌、O2+NS和O2+益生菌。在出生后第7天，分别从左肺和下消化道进行肺和肠道微生物群取样。收集每只小鼠的右肺进行Western blot、细胞因子和组织学分析。结果显示，与RA+NS组和RA+益生菌组相比，O2+NS组的体重和血管密度显著降低，平均内衬间隔(MLI)和肺细胞因子水平显著升高。在肠道微生物群属水平上，与RA+NS组和RA+益生菌组相比，O2+NS组葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠杆菌属(Enterobacter)丰度显著增加，乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著降低。在高氧暴露的新生小鼠中，鼻内给药L. johnsonii增加了血管密度，降低了MLI和细胞因子水平，并恢复了肠道微生物群。综上所述，鼻内给药L. johnsonii可防止高氧引起的肺损伤并调节肠道微生物群。

论文ID

原名：Intranasal administration of Lactobacillus johnsonii attenuates hyperoxia-induced lung injury by modulating gut microbiota in neonatal mice

译名：鼻内给药约氏乳杆菌通过调节新生小鼠肠道微生物群减轻高氧诱导的肺损伤

期刊：Journal of Biomedical Science

IF：11.0

发表时间：2023.7

通讯作者：Chung-Ming Chen

通讯作者单位：台北医学大学附设医院

DOI号：10.1186/s12929-023-00958-8

实验设计

结果

1.存活率

五只雌性小鼠分娩了37只幼崽。将7至11只幼崽随机重新分配给新的母鼠。在高氧环境下饲养的小鼠出现呼吸窘迫。在RA或高氧环境下，给予NS或益生菌处理的小鼠均在出生后第7天存活。

2.鼻内给药L. johnsonii增加高氧诱导的体重下降

四个研究组的平均出生体重相似(图1A)。在RA条件饲养并用L. johnsonii处理的小鼠体重显著高于RA条件饲养并用NS处理的小鼠。在高氧条件下饲养并用L. johnsonii处理的小鼠的体重明显低于在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠。L. johnsonii处理显著增加了出生后第7天高氧诱导的体重下降。

图1.鼻内给药L. johnsonii可增加高氧暴露新生小鼠在出生后第7天的体重和肠道连接蛋白表达。从出生后第0-6天给RA或O2环境中饲养的新生小鼠经鼻给药L. johnsonii或NS。A，出生体重和出生后第7天的体重，B，出生后第7天肠道ZO-1和occludin表达的代表性Western blots和半定量分析。n=7-11。*p<0.05，***p<0.001，双因素方差分析(Bonferroni事后检验)。  

3.鼻内给药L. johnsonii增加肠道连接蛋白的表达

上皮紧密连接由跨膜蛋白ZO-1和occludin形成，它们可控制细胞间通透性，对肠道屏障的完整性至关重要。本研究检测了ZO-1和occludin的表达以评估益生菌对肠道屏障完整性的影响。在高氧条件下饲养并用NS处理的小鼠，其ZO-1和occludin蛋白表达显著低于在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠(图1B)。与NS处理组相比，L. johnsonii处理显著增加了高氧诱导的ZO-1和occludin蛋白表达的下降。  

4.鼻内给药L. johnsonii可改善肺泡化并增加VEGF表达和肺血管生成

在出生后第7天观察用苏木精-伊红染色的肺组织切片(图2A)。在RA条件下饲养并用NS处理的小鼠肺形态正常。相较于在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠，在高氧条件下饲养并用NS处理的小鼠具有较大的薄壁气腔，MLI水平显著升高。L. johnsonii处理显著降低了高氧诱导的MLI水平的升高。图2B显示了肺组织切片中vWF的代表性免疫组织化学染色。VEGF是一种血管生成所必需的内皮细胞有丝分裂原。在高氧条件下饲养并用NS处理的小鼠的vWF免疫反应性明显降低。半定量分析显示，在高氧条件下饲养并用NS处理的小鼠，其VEGF表达和血管密度显著低于在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠(图2B)。与NS处理相比，L. johnsonii处理显著增强了高氧诱导的VEGF蛋白水平和血管密度的下降。

图2.鼻内给药L. johnsonii改善了出生后第7天的肺泡化，增加了VEGF表达和肺血管生成。A，出生后第7天的代表性肺组织学和MLI。B，vWF代表性免疫组化染色(黑色箭头)以及VEGF和血管密度的代表性Western blots和半定量分析。L. johnsonii处理显著降低了高氧诱导的MLI增加，并显著增强了高氧诱导的VEGF蛋白水平和血管密度的降低。n=7-11。*p<0.05，***p<0.001，双因素方差分析(Bonferroni事后检验)。

5.鼻内给药L. johnsonii可减少高氧诱导的肺细胞因子升高

在高氧条件下饲养并用NS处理小鼠，其肺IL-1、IL-6和TNF-α水平显著高于在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠(图3)。L. johnsonii处理显著抑制出生后第7天高氧诱导的肺IL-1和IL-6水平的升高。

图3.鼻内给药L. johnsonii可降低高氧诱导的肺细胞因子升高。与在RA条件下饲养并用NS或L. johnsonii处理的小鼠相比，在高氧条件下饲养并用NS处理的小鼠的肺IL-1、IL-6和TNF-α水平显著升高。L. johnsonii处理显著抑制了出生后第7天高氧诱导的肺IL-1和IL-6水平的升高。n=7-11。*p<0.05，***p<0.001，双因素方差分析(Bonferroni事后检验)。

6.鼻内给药L. johnsonii可调节肠道微生物群

在门和属水平上分析微生物群组成，以探索微生物物种及其相对丰度。在门水平上，前四个门(即厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes和放线菌门Actinobacteria)占四个组序列的99%以上(图4A)。O2+NS组肠道菌群主要由变形菌门和拟杆菌门组成，而L. johnsonii处理并未显著降低变形菌门和拟杆菌门的丰度。在属水平上，前六个属(乳杆菌属Lactobacillus、葡萄球菌属Staphylococcus、肠杆菌属Enterobacter、拟杆菌属Bacteroides、链球菌属Streptococcus和Escherichia/Shigella)占四个组序列的97%以上(图4B)。相较于RA+NS组和RA+益生菌组，O2+NS组葡萄球菌属(p<0.01)和肠杆菌属丰度显著升高(p<0.05)，而乳杆菌属丰度显著降低(p<0.01)。L. johnsonii处理显著降低了葡萄球菌属和肠杆菌属的丰度，增加了乳杆菌属的丰度。

如图4C所示，O2+NS组肠道微生物组的α多样性显著高于RA+NS和RA+益生菌组。L. johnsonii给药显著降低了O2组的α多样性，且α多样性值接近RA+NS和RA+益生菌组。此外，非加权UniFrac距离的PCoA揭示了这些组间的显著差异(图4D，p<0.001)。我们进行了线性判别分析(LDA)来确定组间微生物组组成的差异。如图4E所示，O2或L. johnsonii处理后乳杆菌目Lactobacillales(目)、乳杆菌科Lactobacillaceae(科)、乳杆菌属Lactobacillus(属)、丁酸球菌科Butyricicoccaceae(科)和产丁酸菌属Butyricicoccus(属)减少。O2+NS组中理研菌科Rikenellaceae(科)、Alistipes(属)、Aerococcaceae(科)、Aerococcus(属)、肠球菌科Enterococcaceae(科)、肠球菌属Enterococcus(属)、明串珠菌科Leuconostocaceae(科)、魏斯氏菌属Weissella(属)、Staphylococcales(目)、葡萄球菌科Staphylococcaceae(科)、葡萄球菌属Staphylococcus(属)、变形菌门Proteobacteria(门)、γ变形菌Gammaproteobacteria(纲)、肠杆菌目Enterobacterales(目)、肠杆菌科Enterobacteriaceae(科)、肠杆菌属Enterobacter(属)、Escherichia_Shigella(属)和Erwiniaceae(属)丰度较高。O2+益生菌组中Corynebacteriales(目)、诺卡氏菌科Nocardiaceae(科)、Rhodococcus(属)、弯曲杆菌门Campilobacterota(门)、Campylobacteria(纲)、Campylobacterales(目)、Campylobacteraceae(科)、弯曲杆菌属Campylobacter(属)、绿弯菌门Chlorofexi(门)、Chlorofexia(纲)、Termomicrobiales(目)、JG30_KF_CM45(科)、Fenollaria(属)、Patescibacteria(门)、Saccharimonadia(纲)、Saccharimonadales(目)、Saccharimonadaceae(科)、Caulobacterales(目)、Caulobacteraceae(科)和短波单胞菌属Brevundimonas(属)丰度较高。

图4.鼻内给药L. johnsonii可调节高氧暴露新生小鼠的肠道微生物群。A，门水平上的细菌组成。B，属水平上的细菌组成。C，α多样性。D，β多样性。E，线性判别分析。鼻内给药L. johnsonii改变了O2+NS组(n=10)、RA+NS组(n=7)、RA+益生菌组(n=10)和O2+益生菌组(n=9)肠道微生物群的细菌组成和多样性。双因素方差分析(Bonferroni事后检验)。PNR：RA+NS，PLR：RA+益生菌，PNH：O2+NS，PLH：O2+益生菌。 

7.鼻内给药L. johnsonii对肺部微生物群的影响

在门水平上，前四个门(即厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门)占四个组序列的＞95%以上(图5A)。在属水平上，前10个属占四个组序列的75%以上(图5B)。在门和属水平上，四组之间的微生物群组成具有可比性。在肺部微生物群的丰富度分析中，四组之间的α多样性差异并不显著(图5D)。非加权UniFrac距离的PCoA显示各组间存在显著差异(图5D，p<0.05)。如图5E所示，O2+NS组葡萄球菌目(目)、葡萄球菌科(科)和葡萄球菌属(属)的丰度较高。

图5.鼻内给药L. johnsonii对肺部微生物群的影响。A，门水平上的细菌组成。B，属水平上的细菌组成。C，α多样性。D，β多样性。E，线性判别分析。鼻内给药L. johnsonii改变了O2+NS组(n=10)、RA+NS组(n=7)、RA+益生菌组(n=10)和O2+益生菌组(n=9)肺部微生物群的细菌组成和多样性。双因素方差分析(Bonferroni事后检验)。PNR：RA+NS，PLR：RA+益生菌，PNH：O2+NS，PLH：O2+益生菌。

8.优势肠道微生物群与肺损伤参数的相关性

为明确哪些特定细菌可减轻高氧诱导的肺损伤，本研究进行了优势细菌属与肺发育参数和炎症标志物的Spearman相关性分析(图6)。葡萄球菌属和肠杆菌属的丰度与MLI和肺细胞因子水平呈正相关，与出生后第7天的体重和血管密度呈负相关。然而，乳杆菌属丰度与MLI和肺细胞因子水平呈负相关，与出生后第7天的体重和血管密度呈正相关。

图6.优势肠道微生物属、肺发育参数和肺损伤参数的相关性热图。蓝色表示正相关。红色表示负相关。

9.L. johnsonii对预测代谢通路的影响

根据四组微生物群落预测肠道和肺部的代谢通路。结果表明，在高氧处理诱导的代谢通路中，维生素K2的生物合成途径存在显著差异。因此，本研究选择并讨论了与维生素K2相关的生物合成途径，包括PWY-5838、PWY-5840、PWY-5845、PWY-5850、PWY-5860、PWY-5861、PWY-5862、PWY-5896、PWY-5897、PWY-5898、PWY-5899(表1)。高氧处理提高了维生素K2生物合成预测代谢通路的代谢活性，包括PWY-5838、PWY-5840、PWY-5845、PWY-5850、PWY-5860、PWY-5861、PWY-5862、PWY-5896、PWY-5897、PWY-5898和PWY-5899(图7A和B)。L. johnsonii处理降低了维生素K2生物合成的代谢活性，其中PWY-5838、PWY-5840、PWY-5845、PWY-5850、PWY-5861、PWY-5896、PWY-5897、PWY-5898和PWY-5899的影响均低于-0.5(图7A和B)。此外，只有RA+NS组和O2+益生菌组表现出显著性，在肠道中的作用大于0.5(图7A)，但在肺部没有(图7B)。RA+NS组和RA+益生菌组对维生素K2生物合成途径没有显著影响(图7A和B)。这些结果表明，L. johnsonii处理减少了肠道和肺部高氧处理诱导的维生素K2生物合成途径。

表1. 代谢通路的说明。

图7.在肠道(A)和肺(B)中，高氧或L. johnsonii处理之间的差异丰富预测代谢通路的维生素K2相关生物合成途径。使用ALDEx2进行丰度分析(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。  

讨论

本研究的动物模型显示，在分娩后的前7天暴露于高氧浓度会导致新生小鼠体重降低，肺细胞因子水平升高和肺发育受损。鼻内给药L. johnsonii可改善肺发育，较低的MLI和细胞因子水平以及较高的VEGF表达和血管密度证明了这一点。肺发育的改善伴随着肠道微生物群的正常化。本研究发现，鼻内给药L. johnsonii可以抑制肺部炎症并防止高氧引起的肺损伤。因此，鼻内给药L. johnsonii是新生儿高氧所致肺损伤的潜在治疗方法。 在本研究中，所有小鼠出生时体重相似，食物中的营养成分也相似。结果发现，在RA或高氧条件下饲养并用L. johnsonii处理的小鼠体重较NS组小鼠显著升高。在高氧条件下饲养并用L. johnsonii处理的小鼠的肠道连接蛋白表达明显高于在RA条件下饲养并用NS处理的小鼠。这些结果表明，益生菌可以保护肠粘膜的完整性并促进消化和吸收。这些发现与Li等人的研究结果一致，他们发现补充益生菌的小鼠肠道消化酶活性更高，并且在不增加食物摄入量的情况下具有更高的体重。 来自罗伊氏乳杆菌的可溶性因子可显著降低脂多糖刺激巨噬细胞产生的促炎细胞因子(即IL-6和TNF-α)，并减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤。在先前的一项研究中，口服L. johnsonii可降低肥胖小鼠血清C反应蛋白和肝脏TNF-α mRNA的表达，改善肠道环境。本研究发现，L. johnsonii抑制了高氧引起的肺细胞因子水平升高，这与其他研究的结果一致；这一发现表明乳杆菌具有抗炎作用。 通过LEfSe算法，我们确定了每组微生物群中富集或减少的特定分类群。在生命最初的7天中，高氧暴露改变了小鼠肠道微生物群的细菌群落组成。在前6个肠道菌群属(即乳杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、拟杆菌属、链球菌属和Escherichia/Shigella)中，与RA+NS组和RA+益生菌组相比，O2+NS组肠道内葡萄球菌属和肠杆菌属的丰度显著增加，乳杆菌属的丰度显著降低。这些结果与Li等人的研究一致，他们发现高氧促进葡萄球菌和肠杆菌的生长，抑制乳杆菌的生长。由于厌氧细胞中的直接氧毒性以及有毒氧副产物和活性氧的产生，乳杆菌被抑制，这些物质可能会损害DNA、蛋白质和脂质并导致细胞死亡。 作者之前的研究发现，新生大鼠出生后0-7天的高氧暴露会降低紧密连接蛋白(occludin和ZO-1)的表达，破坏肠道屏障，增加肠道通透性和细菌易位，损害肠道功能。本研究证明了高氧暴露的新生小鼠肠道微生物群发生改变，葡萄球菌属和肠杆菌属丰度增加，而乳杆菌属丰度降低。肠道微生物群落的这些变化与肠道交界蛋白水平降低和高氧诱导的肺损伤改善(即减少肺部炎症、改善肺泡化和血管生成)有关。Wang等人发现，小鼠呼吸道流感可导致肠道微生物群发生变化。此外，他们发现微生物群落的改变并不是因为肠道中的活动性流感感染，而是最终导致肠道免疫损伤和炎症。此外，在暴露于高氧的新生小鼠中，鼻内给药L. johnsonii可防止肠道微生物群破坏，这意味着肺发育受损与肠道微生物群组成之间存在联系，并提示高氧引起的肺损伤中存在肠-肺轴。 乳杆菌在呼吸系统疾病的治疗中有积极作用，许多动物实验和临床试验证实了其疗效。乳杆菌通过肠-肺轴影响肺部微环境的可能机制是通过肽聚糖、细胞外多糖、表面蛋白、代谢物(短链脂肪酸)和无机多磷酸盐液体调节免疫系统。另一种可能的机制是乳杆菌通过呼吸道黏膜免疫细胞上的模式识别受体(如Toll样受体或NOD样受体等)影响肺部微环境，并激活下游通路。 本研究存在一些局限性。首先，本文没有分析肠道微生物群落代谢物与免疫稳态之间的关联，尽管已经提出了代谢物与免疫稳态之间的几种潜在联系来解释肠-肺轴。微生物或微生物成分可以通过淋巴转运到肺部，而肠道微生物群产生或改变的代谢物会影响肺部生理。其次，没有分析新生小鼠的鼻腔微生物群。虽然鼻腔微生物组可以预测早产儿BPD，但鼻腔微生物群与高氧诱发的肺损伤之间的关系尚不清楚。    

结论

本研究发现鼻内给药L. johnsonii可改善高氧暴露新生小鼠的肺部发育；降低MLI和肺细胞因子水平；并增加血管密度。结果还表明，鼻内给药L. johnsonii可增加新生小鼠体重。此外，L. johnsonii可在高氧所致肺损伤后恢复肠道微生物群。目前尚无改善高氧引起的肺损伤的科学治疗方法，但经鼻给药L. johnsonii可预防高氧引起的肺损伤。深入研究控制特定肠道微生物群所产生的结果，例如使用L. johnsonii补充微生物群，可能为管理新生儿高氧相关肺损伤提供治疗方案。

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