10分+针对PBMC中DNA甲基化的多重血液检测能够早期检测乳腺癌

导语

免疫系统可以监测肿瘤的发展，DNA甲基化参与人体对肿瘤的免疫反应。在这项工作中，我们从肿瘤免疫改变的角度研究了外周血单核细胞（PBMC）中的DNA甲基化改变是否可以用作乳腺癌（BC）早期检测的标志物。我们通过结合Infinium 850K BeadChips，焦磷酸测序和靶向亚硫酸氢盐测序来鉴定四种BC特异性甲基化标记物。基于BC的PBMC中的四种甲基化标志物，本研究开发了一种高效便捷的多重甲基化特异性定量PCR检测方法，用于检测BC，并在多中心队列中验证其诊断性能。该测定能够区分早期BC患者和正常对照，AUC为0.940，灵敏度为93.2%，特异性为90.4%。更重要的是，该测定优于现有的临床诊断方法，特别是在检测早期和最小肿瘤方面。

背景介绍 

今天小编为大家带来一篇基于PBMC中四个DNA甲基化标记的简单有效的BC-mqmsPCR检测方法发表在10分+ N ature Communications的思路。题目为A multiplex blood-based assay targeting DNA methylation in PBMCs enables early detection of breast cancer。  

数据介绍

来自发现阶段的全基因组DNA甲基化数据在GEO中（GSE237036），本研究中生成的图表中提供的原始数据在补充信息和源数据文件中提供。本文提供了源数据。

研究设计

2020 年 5 月至 2022 年 7 月期间，共有来自中国六个省份的 10 家医院的 820 名患者参加了这项研究。选择病例的方式是：（i）BC的病理诊断（无需任何治疗，如手术、放疗和化疗）;（ii）没有其他癌症存在;（iii）没有其他已知的炎症性疾病（细菌或病毒感染、哮喘、自身免疫性疾病、活动性甲状腺疾病）可能改变PBMC的特征;（iv）受试者能够理解并签署参与研究的书面知情同意书。对照组没有恶性疾病，并且经常与年龄和种族病例相匹配。所有甲基化测试均在PBMC样品中进行。由于血液样本是在病理诊断和临床治疗之前采集的，因此39份样本被排除在分析之外，原因是：（1）缺乏病理数据;（2）病理证实的良性病变;（3）从PBMC中提取的DNA量不足;（4）低质量的测试。其余781个PBMC样本（366个BC，290个正常对照和125个其他肿瘤）用于DNA甲基化分析，甲基化标记筛选和早期BC诊断方法的开发。研究设计的概述如图1所示。补充数据总结了781名患者以及训练和验证队列患者的临床特征和人口统计学特征。

在发现阶段，本研究在包括50名BC患者和30名正常对照（队列I，n=80）的独立队列中进行全基因组DNA甲基化分析分析，旨在建立DNA甲基化景观并鉴定PBMC中的BC特异性甲基化标记。接下来，在队列II（n=200，110 BC和90个正常对照）中验证了可用于BC诊断的已鉴定甲基化标志物，包括焦磷酸测序组（n=100，50 BC和50个正常对照）和TBS组（n=100，60 BC和40个正常对照）。最后，将多中心队列III（n=501，206 BC，170个正常对照和125个其他肿瘤）分为训练集和验证集，用于开发和评估BC-mqmsPCR BC诊断测定。

结果解析

01、全基因组DNA甲基化分析揭示了BC的PBMCsDNA甲基化景观

为了探索PBMC中的BC特异性DNA甲基化标记，我们使用Infinium人甲基化850 K BeadChip检查了来自50名BC患者和30名正常对照的PBMC中的全基因组DNA甲基化状态。归一化和批量校准后，共鉴定出820,000个标记物，用于后续分析。PCA图显示BC和正常对照之间几乎没有差异。CpG 位置与 |Δβ |≥0.06和p值≤0.01定义为差异甲基化的CpG位置（DMP）。 

BC和正常对照之间有289个DMP（194个基因），其中112个DMP（38.8%）在肿瘤中显着超甲基化，177个DMP（61.2%）在肿瘤中显着低甲基化（图2a）。这一结果与之前对癌症总体5mC变化的研究一致，该研究在大量低甲基化变化 中发现了少量的高甲基化事件。DMP的基因组分布显示，低DMP和炒作DMP分别占基因体区域的31.6%和23.0%，低甲基化事件更频繁，这与正常细胞中基因体甲基化程度更高一致（图2b）。DMP的分布在染色体之间有所不同。此外，与正常对照相比，BC患者的转录起始位点（TSS）被低甲基化（图2c），这可能与BC患者的免疫激活有关，然后对差异甲基化的基因进行通路分析。值得注意的是，与DMP相关的基因在与免疫监视和免疫编辑系统相关的途径中富集（图2d）。这些结果支持了BC患者PBMC中DNA甲基化变化与宿主免疫反应相关的假设。

图2

02、鉴定PBMC中的DNA甲基化标志物，以区分BC患者与正常对照

接下来，我们应用了一系列筛选原理来鉴定BC最重要和最特异的DNA甲基化标记。通过使用LASSO分析，获得了33个甲基化标记物，并使用|Δβ|≥0.08，p值≤0.0001筛选原理（基于Champ DMP函数），获得8个甲基化标记，其中6个甲基化标记在2个筛选标准中重叠。在去除了两个难以用引物设计的甲基化标记（cg21723696和cg14928964）后，我们最终选择了四个重叠的甲基化标记（cg14507403、cg09821790、cg15694422和cg27527887）和两个甲基化标记（cg11754974和cg16652347）仅满足|Δβ|≥0.08，p值≤0.0001筛选原理进一步验证。鉴于TSS区域的甲基化已被证明在调节基因表达 方面比其他CpG位点更重要，我们在TSS区域纳入了另外两个甲基化位点（cg13828440 / KLRD1和cg18637238 / KLRK1），它们可能与BC的发展有关。Varker等人表明，侵袭性BC患者的癌症相关应激与免疫损伤有关。在表现出高水平的癌症相关心理压力的患者中，NK细胞毒性降低，CD94（KLRD1）水平降低 。Starčević等证实，肿瘤侵袭中NK细胞活化的调节可能与BC的发病机制有关。BC患者外周NK细胞活化受体（CD94/NKG2C、NKG2D和CD16）和抑制受体（NKG2A）的表达降低，凸显了NK细胞在BC免疫抑制肿瘤微环境中作为有效抗肿瘤应答的合适靶标的重要性。Kruijf等证实NKG2D配体（NKG2DL）在BC中常高表达，NKG2DL可与存在于NK细胞和T细胞亚群上的激活NKG2D（KLRK1）受体结合，从而启动免疫应答，在BC肿瘤免疫编辑中起关键作用。其他研究将NKG2D与BC的发展联系起来。因此，共选择8个候选标记进行最终验证，包括4个高甲基化标记和4个低甲基化标记（图3a）。

为了排除PBMC细胞混合物分布对DNA甲基化的影响，我们根据EpiDISH方法计算了细胞比例，发现BC患者的单核细胞比例明显高于对照组，BC中的NK细胞比例明显低于正常对照组，但在CD8 + T细胞，CD4 + T细胞中没有，B细胞和粒细胞。尽管如此，调整细胞比例后，八个标志物在BC和正常对照之间仍显示出显着差异。

在200名患者的队列中使用焦磷酸测序和TBS评估了这8种标志物的可重复性。结果显示，BC与正常对照组4个低甲基化标志物（cg14507403、cg09821790、cg15694422和cg27527887）差异无统计学意义;而其他4个高甲基化标志物在BC患者中表现出稳定的更高甲基化水平，与焦磷酸测序和TBS的正常对照相比（图3b）。值得注意的是，TCGA中cg16652347和cg13828440位点的甲基化差异趋势与PBMC的甲基化差异趋势截然相反，这证明我们检测到的甲基化差异来自PBMC，而不是BC组织。由于TCGA中的所有数据都是通过450K芯片测序的，不包括我们在850K芯片中筛选的两个位点（cg11754974和cg18637238），因此无法评估BC和邻近正常组织中这两个位点之间的甲基化差异。

有趣的是，我们发现在焦磷酸测序集中，cg18637238的甲基化水平与肿瘤大小呈负相关，在小肿瘤（≤1.5cm）中甲基化显着更高。年龄、淋巴结转移状态、ER状态、PR状态、HER2状态或Ki67水平无显著差异。在TBS组中，0/I期或II期BC中cg11754974、cg13828440和cg18637238的甲基化水平高于III/IV期，肿瘤大小、年龄、淋巴结转移状态、ER状态、PR状态、HER2状态或Ki67水平无明显差异（图3c）。接下来，为了表征这些甲基化标志物在检测早期BC和小尺寸BC肿瘤中的潜力，我们建立了受试者工作特征（ROC）曲线。正如预期的那样，每个甲基化标志物都可以将早期BC和小肿瘤（≤1.5cm）与两组中的正常对照区分开来（图3d）。这4个标记的无监督分层聚类能够以中等特异性和敏感性将BC与正常对照区分开来（图3e）。

图3

03、BC-mqmsPCR检测试剂盒的开发与应用 

为了在临床上以快速、经济高效且更方便的方式检测多种标志物，我们开发了一种有效的方法来诊断BC，BC-mqmsPCR，该方法允许在单个反应 中同时多重定量四个甲基化标志物。使用两种不同的荧光基团探针进行BC-mqmsPCR检测。选择FAM荧光团标记4个甲基化标记物，使用VIC荧光团标记ACTB参比对照。ΔCT值代表甲基化水平（ΔCT=CT reference – CT biomarker ）。 

为了验证BC-mqmsPCR测定的可行性，我们将4标记BC-mqmsPCR测定与使用来自同一案例的亚硫酸氢盐转化PBMCsDNA的单个标记qMSP测定进行了比较。BC-mqmsPCR 测定产生的 ΔCT 值分别比单个 cg11754974、cg16652347、cg13828440 和 cg18637238 测定高 2.22、5.95、0.71 和 1.76，证实了多重测定可以实现荧光信号积累，并且在分析上比单个测定更灵敏（图4a）。为了验证BC-mqmsPCR测定是否可用于区分BC患者和正常对照，我们进行了4标记BC-mqmsPCR测定和单个标记qMSP测定，以检测40例BC患者和40例正常对照的甲基化水平（源自队列III中的训练集）。在BC-mqmsPCR测定和qMSP测定中，BC患者的甲基化水平均高于正常对照组，但4标记BC-mqmsPCR测定的AUC显着高于每个单独的标记qMSP测定（0.925 vs 0.811，0.785，0.760和0.793），表明通过组合单个标志物可以提高qMSP的诊断性能。尽管使用LASSO分析称量单个标记物也可以将性能提高到多重分析的水平（AUC = 0.94）。然而，这项研究的重点是寻找一种更方便、更快速、更经济的检测方法。多重分析不仅可以满足临床快速便捷的临床检测需求，而且诊断效率高。然后，通过将50 ng/ul亚硫酸氢盐转化的PBMCs DNA与纯水混合并将其稀释至 50、10、1、0.1、0.01和0.001%，进一步评估了BC-mqmsPCR测定和每个标记物qMSP测定的分析灵敏度。结果表明，BC-mqmsPCR检测的定量检测限为0.01%（图4b），远低于cg11754974的1%，cg16652347、cg13828440和cg18637238的定量检测限为0.1%，表明BC-mqmsPCR是一种更灵敏的检测方法。 

为了进一步评估BC-mqmsPCR检测在临床应用中的性能，我们从中国十家医院招募了206名BC患者和170名正常对照的多中心队列，并分为训练集和验证组。从六个中心招募训练集（130 BC和115个正常对照）进行方法开发和寻找最佳临界值，并从另外四个中心招募验证集（76 BC和55个正常对照）进行外部验证。结果表明，在训练集和验证集中，BC组的甲基化水平均显著高于正常对照组（图4c，d）。我们还检查了BC-mqmsPCR的性能，其对训练和验证集表现出AUC（0.925和0.918），灵敏度（83.1和80.3%）以及特异性（90.4和89.1%）（图4e-h）。更重要的是，通过训练集中尤登指数（3.223）的临界值确定BC-mqmsPCR的正负分类后，我们发现BC-mqmsPCR的预测结果与病理诊断结果具有较高的一致性（图4i，j）。此外，共招募了125例其他癌症患者，包括42例结直肠癌，42例肺癌和41例胃癌，以评估BC-mqmsPCR对BC的诊断特异性。结果表明，BC-mqmsPCR可以区分BC与其他非BC患者，AUC为91.3%（图4k，l）。

图4

04、BC-mqmsPCR在早期BC检测中的应用

BC的早期诊断是降低患者死亡率的关键。鉴于单个标志物在微小肿瘤和早期BC中显示出良好的诊断价值，我们进一步评估了BC-mqmsPCR在早期BC中的性能。如图5a所示，0/I期和II期BC患者的甲基化水平明显高于III期患者，BC-mqmsPCR在训练和验证集中表现出AUC（0.940和0.927）和灵敏度（93.3和85.7%）（图5b，c）。重要的是，BC-mqmsPCR可以诊断最小的肿瘤（≤1.5厘米），AUCs高达0.945和0.936，训练集和验证集中的灵敏度分别高达93.2%和90.0%（图5d，e）。这些结果表明，BC-mqmsPCR测定是早期识别小肿瘤的补充方法，这是超声和乳房X线摄影难以识别的。 

这种方法的潜在效用在两个病例（来自队列III的训练集）中得到了强调，这些病例通过BC-mqmsPCR诊断，但被超声，乳房X光检查和血清肿瘤标志物CEA，CA153和CA125遗漏（图5f）。患者#1因体格检查中存在左乳结节而入院3年。乳腺超声显示左乳3个低回声结节，边界清晰，内部回声不均匀，与BI-RADS3级（阴性）一致（图5g）。乳房X线检查显示左上乳腺比对侧乳腺密度略大，左下乳象限可见圆形钙化病灶，与BI-RADS2级（阴性）一致（图5h）。然而，BC-mqmsPCR检测诊断为BC阳性，这与术后病理显示低级别导管原位癌一致，肿瘤切除面积为1.5×0.6cm（图5i）。在另一例病例中也观察到了类似的情况，该病例被诊断为BC-mqmsPCR，病理学上被确认为中/高级别导管原位癌，但超声和乳房X光检查漏诊。这些结果有力地证明了BC-mqmsPCR在检测最小尺寸肿瘤和早期BC方面的优势。

图5

05、BC-mqmsPCR优于传统的BC诊断方法

我们比较了BC-mqmsPCR与目前使用的肿瘤标志物CA153、CEA和CA125在67例早期BC患者（训练集和验证集中具有完整CEA、CA153、CA125和BC-mqmsPCR信息的0-1期BC患者）和113例中小质量BC患者（肿瘤大小≤2.5 cm BC患者伴完全CEA，CA153、CA125和BC-mqmsPCR信息分别在训练集和验证集中）。4种方法的临床特点和诊断性能如图5j所示。令人惊讶的是，BC-mqmsPCR在17例0期BC病例中检出15例（88.2%），主要以原位癌为特征，而CEA仅发现1例（1/17，5.9%），没有一例由CA153（0%）或CA125（0%）检测到。由于传统的肿瘤标志物CEA、CA153和CA125可能仅用于晚期BC患者，因此对早期BC的筛查或诊断没有帮助。例如，CA153浓度在10%的I期疾病患者中升高，20%患有II期疾病，40%患有III期疾病，75%患有IV期疾病，因此BC早期传统肿瘤标志物的检出率非常低。此外，BC-mqmsPCR检测BC小结节（≤1.5 cm）患者的灵敏度（91.7%）高于CA153（0%）、CA125（2.1%）和CEA（0%）。

BC-mqmsPCR的总体检出率为82.0%，显著高于CA153（5.3%）、CEA（6.0%）和CA125（3.5%）（补充图4e和补充表6）。重要的是，BC-mqmsPCR对CA125、CEA和CA153阴性BC患者的诊断敏感性分别为82.42%、81.41%和81.99%。总的来说，我们的结果表明，已建立的BC-mqmsPCR测定有可能作为临床诊断方法，特别是对于早期BC患者。 

DNA甲基化改变发生在肿瘤生长的开始。之前对20万人进行的一项纵向研究表明，基于DNA甲基化的血液测试可以在常规诊断前四年检测出五种类型的癌症。此外，由伦敦大学学院领导的一项研究发现，BC样本的EFC#93 DNA区域显示出异常的DNA甲基化模式，可用于诊断肿瘤的时间比现有的筛选方法早一年。因此，我们对170例正常对照患者进行了随访研究，分为训练组（115例正常对照组）和验证组（55例正常对照组），发现在预测为阳性的17例患者中（2例失访），有2例在随访1年内被诊断为BC;此外，在153例阴性患者中（22例失访），随访1年内未确诊BC。我们推测，上述结果可能是由以下原因引起的。首先，一些BC-mqmsPCR检测呈阳性的患者体内可能有癌变，但目前的临床检测方法无法检测到，直到肿瘤发展到一定大小后，才会通过临床常规检测方法予以确认;其次，目前BC的临床诊断主要依靠影像学检查，而现有的影像学检查有其局限性（致密乳腺患者的假阴性高，取决于临床医生的水平等），因此不能排除因影像学检查假阴性而错误分组的患者。第三，BC-mqmsPCR的检测方法也存在一定的假阳性。靶序列或扩增产物的交叉污染是导致假阳性的重要因素，其中气溶胶污染是最常见的。PCR试剂和样品的交叉污染也可能导致假阳性。对此，应规范实验室设计，在连续独立空间内完成不同的实验操作。定期通风消毒，并使用气溶胶去除剂。使用一次性餐具或高压灭菌的耗材，以避免交叉污染。随着随访时间的延长，这些患者不会发展为BC。 

因此，我们建议对无BC危险因素且BC-mqmsPCR检测呈阳性的患者，每6个月进行一次乳房超声或乳腺X线摄影检查，然后在12个月和24个月后进行一次检查。如果病变保持稳定，可以每1-2年重新检查一次。BC-mqmsPCR 检测呈阳性的 BC 高危因素患者应每 3 个月复查一次。然后在6、12 和 24 个月时对其进行复查。如果病变保持稳定，此后可每 1 年复查一次。 

讨论

本研究开发了一种基于PBMC中四个DNA甲基化标记的简单有效的BC-mqmsPCR检测方法，用于BC的快速无创诊断。该方法具有较高的敏感性和特异性，特别适用于早期BC和微小肿瘤的检测。此外，BC-mqmsPCR还可以比现有的临床程序更早地识别肿瘤，显示出进一步改善BC早期诊断和患者预后的潜力。

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