胃癌分冷热？ARID1A突变HER2阴性胃癌免疫治疗或更有效

本研究旨在分析前瞻性试验中HER2阳性和阴性胃癌患者可能影响肿瘤进展和治疗反应的基因特征。从参加TROX-A1试验（UMIN000036865）的胃癌患者中收集了80份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本（49例HER2+，31例HER2-）。使用435基因panel（CANCERPLEX-JP）获得全面的基因组分析数据，包括肿瘤突变负荷，体细胞突变和拷贝数变异。分析HER2+和HER2-胃癌患者的基因特征差异。突变分析表明，TP53是突变频率最高的基因，无论HER2状态如何。ARID1A突变在HER2阴性患者中显著富集。具有ARID1A突变的HER2阴性患者的总突变数目显著高于HER2阳性患者。拷贝数变异分析表明，HER2阳性患者基因扩增（如CCNE1、PGAP3和CDK12）数目显著高于HER2阴性患者。PTEN缺失在HER2阳性患者中更为常见。与HER2阳性患者相比，HER2阴性患者往往具有更高的肿瘤突变负荷，特别是ARID1A突变患者。基因变异通路分析显示，HER2阴性患者中几条免疫相关通路富集。根据HER2阳性和阴性胃癌的基因组分析，HER2通路的几种基因变异可能是曲妥珠单抗耐药的潜在机制。与HER2阳性胃癌相比，具有ARID1A突变的HER2阴性胃癌可能对免疫检查点抑制剂敏感。

研究背景

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。转移性胃癌患者靶向治疗选择有限，预后不良。近年来，关注基因变异的精准医疗改善了实体瘤（包括胃癌）患者的预后。在胃癌中，已经开发出靶向疗法，对人表皮生长因子受体2（HER2）阳性，微卫星高度不稳定（MSI-H），神经营养酪氨酸受体激酶（NTRK）基因融合的患者有效。最近，3期临床试验SPOTLIGHT显示，抗claudin 18.2抗体Zolbetuximab改善了claudin 18.2阳性HER2阴性胃癌患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）（NCT03504397）。此外，有临床研究正在评估成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂在胃癌中的疗效（TAS-120：NCT04189445；FORTUNE Trial：NCT04962867）。这些发现可能有助于在未来提供新的标准疗法。随着用于基因组分析的下一代测序（NGS）方法的兴起，有关靶向治疗的研发方法和临床实践都发生了巨大变化。

由ERBB2基因编码的HER2在约15%的胃癌患者中过表达/扩增。ERBB2是癌基因，通过激活PI3K/Akt通路驱动肿瘤进展。因此，靶向HER2是治疗HER2过表达胃癌的一种有吸引力的策略。2010年，ToGA试验表明，曲妥珠单抗（抗HER2抗体）联合化疗为HER2阳性胃癌患者带来生存获益。曲妥珠单抗组的中位OS为13.8个月，而仅化疗组为11.1个月（风险比（HR）= 0.74；95%置信区间（CI）= 0.60–0.91；p = 0.0046）。这些结果确立了曲妥珠单抗联合化疗作为HER2阳性胃癌患者的一线治疗。然而，一些HER2阳性胃癌并未获益于曲妥珠单抗治疗。先前的几项研究提供了免疫组化（IHC）数据，表明磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）低表达是胃癌曲妥珠单抗耐药的原因。为了进一步阐明抗HER2治疗耐药机制，使用NGS对HER2阳性胃癌进行全面的基因组分析可能是一种有效的方法。

我们之前通过全面的基因组分析识别了参与胃癌进展的几个新的驱动基因。在本研究中，我们使用NGS大panel评估了80例参加TROX-A1试验（UMIN000036865）的胃癌患者的基因图谱。比较了49例HER2阳性和31例HER2阴性胃癌患者的基因图谱，探索了胃癌患者基因特征差异对肿瘤进展和治疗反应的潜在影响，包括抗HER2治疗耐药机制。

研究结果

80例胃癌患者组织样本NGS基因检测结果

纳入了49例HER2阳性和31例HER2阴性胃癌患者（TROX-A1试验，图1）。使用CANCERPLEX-JP获得了80例胃癌患者的基因图谱。在49例HER2阳性胃癌患者中发现了98个非同义突变、107个扩增和114个缺失。在31 例HER2阴性胃癌患者中发现了74个非同义突变、31个扩增和61个缺失。分别分析HER2阳性和HER2阴性患者的基因图谱（图2A，B）。如图2所示，在HER2阳性胃癌患者中，体细胞突变发生率最高的基因是TP53（78%）、APC（14%）和RHOA（12%），最常见的CNV是的ERBB2扩增（63%），CDK12扩增（39%）和PGAP3扩增（39%）。在HER2阴性患者中，TP53突变（65%）、ARID1A突变（32%）、RHOA突变（23%）、STK11缺失（29%）、AMER1缺失（19%）和TSC2缺失（16%）是最常见的基因变异。

图1. TROX-A1试验研究流程（n=80）

图2. HER2阳性和HER2阴性患者的基因图谱

HER2阳性和HER2阴性胃癌非同义突变比较

接下来，比较了HER2阳性和HER2阴性胃癌患者的非同义突变。HER2阳性和HER2阴性患者的非同义突变数目没有显著差异（图3A）。然而，具有ARID1A突变的HER2阴性患者的总突变数目显著高于HER2阳性患者（图3A，Mann-Whitney U检验p = 0.003）。具有ARID1A突变的HER2阴性肿瘤和具有ARID1A突变的HER2阳性肿瘤的中位非同义突变数目分别为4和5.5。火山图展示了基于HER2状态的非同义突变的富集（图3B）。ARID1A突变在HER2阴性患者中显著富集（Fisher精确检验p <0.001）。KRAS，RHOA，SMAD4，FBXW7，SMO，ATM，MAP2K1，JUN，PTPRT，SMARCA4，TET2，FANCC，CCND2，PALB2，BRCA1，SMAD2和PI3KCA突变在HER2阴性患者中富集，尽管不显著。RNF43，APC，PTEN，POLE和TGFBR2突变在HER2阳性患者中富集。

图3. HER2阳性和HER2阴性胃癌非同义突变差异

HER2阳性和HER2阴性胃癌CNV比较

然后，比较HER2阳性和HER2阴性胃癌患者的CNV。HER2阳性患者的基因扩增数目明显高于HER2阴性患者（图4A，Mann-Whitney U检验p = 0.001）。HER2阳性和HER2阴性患者的基因缺失数目没有显著差异（图4B）。ERBB2，CDK12和PGAP3扩增在HER2阳性患者中显著富集（图4C，Fisher精确检验p<0.01）。TOP2A，CCNE1，MYC，MET和EGFR扩增，以及PTEN，AXIN1，CDKN2A，CDKN2B，MEN1和TP53缺失在HER2阳性患者中富集，尽管不显著（图4C，D）。在HER2阴性患者中，富集的CNV包括PRKCI，ZNF217，KRAS，PIK3CA，CDK6，GNAS，FGFR2，MYCL，FLT1，KLF5，SRC，BRCA1，MDM2和FLT1扩增，以及TSC1，CDKN1A，TGFBR2，APC，SMAD2和CDKN1B缺失（图4C，D）。

图4. HER2阳性和HER2阴性胃癌CNV差异

通路分析

根据富集的基因变异，进行通路分析，探索HER2阳性和阴性胃癌患者肿瘤进展机制。使用DAVID评估KEGG通路富集。在HER2阳性和阴性患者中均显著富集的通路定义为共同通路，仅在HER2阳性或阴性患者中显著富集的通路定义为独有通路。如图5所示，识别了14条共同通路，其中大多数对肿瘤发生和进展很重要。只有1条通路，癌症转录失调，是HER2阳性患者独有通路。识别了17条HER2阴性患者独有通路，包括几条免疫相关通路。

图5. HER2阳性和HER2阴性胃癌富集基因变异的通路分析

HER2阳性与HER2阴性胃癌TMB比较

分析HER2阳性和HER2阴性胃癌患者的TMB差异。HER2阳性患者，HER2阴性患者和具有ARID1A突变的HER2阴性患者的中位TMB值分别为14.6，16.2和17.7 muts/Mb（图6A，Mann-Whitney U试验，HER2阳性vs HER2阴性p = 0.15，HER2阳性vs具有ARID1A突变的HER2阴性p = 0.22）。具有ARID1A突变的HER2阳性患者的中位TMB值为16.2。在HER2阴性胃癌患者中，特别是在ARID1A突变患者中，TMB有更高的趋势，尽管差异没有统计学意义。

图6. HER2状态与局部免疫环境因素的相关性

胃癌局部免疫环境与ERBB2扩增的相关性

另外，评估了TCGA数据库胃癌患者ERBB2扩增与局部免疫环境因素的相关性。局部免疫环境因素包括非同义突变数目，CD8A mRNA表达水平和CYT评分（抗肿瘤免疫的定量方法）。ERBB2未扩增患者（n = 323）的非同义突变总数显著高于ERBB2扩增患者（n = 70；图6B，t检验p < 0.001）。此外，ERBB2未扩增患者（n = 338）的CD8A mRNA表达水平（CD8+ T细胞的标志物）和CYT评分均显著高于ERBB2扩增患者（n = 75；图6C，D，t检验p < 0.001）。

HER2/ERBB2的一致性

最后，评估了临床医生使用传统方法确定的HER2状态与CANCERPLEX-JP panel检测的ERBB2扩增的一致性。HER2阳性定义为IHC评分为3或IHC评分为2且FISH HER2/CEP17评分≥2。在总体人群中，HER2/ERBB2的一致性为73.8%（59/80）。在HER2阳性患者中，HER2/ERBB2阳性一致性为63.3%（31/49），在HER2阴性患者中，HER2/ERBB2阴性一致性为90.3%（28/31）。此外，在IHC评分为3的患者中，HER2/ERBB2阳性一致性为67.6%（25/37）。在IHC评分为2且FISH HER2/CEP17评分≥2的患者中，HER2/ERBB2 阳性一致性为50%（6/12）。IHC评分为3的患者HER2/ERBB2阳性一致性高于IHC评分为2且FISH HER2/CEP17评分≥2的患者。

讨 论 

几项研究描述了HER2阳性和HER2阴性胃癌患者基因特征的差异，提示这些患者曲妥珠单抗耐药的潜在机制。然而，大多数是小规模回顾性研究，HER2阳性和阴性胃癌基因特征差异如何潜在影响肿瘤进展尚不清楚。本研究使用CANCERPLEX-JP 435基因panel，分析了参加了前瞻性II期试验的49例HER2阳性和31例HER2阴性胃癌患者的基因图谱。具体而言，我们识别了HER2阳性和HER2阴性患者富集的基因变异和通路，探索了基因特征差异对肿瘤进展和治疗反应的潜在影响（图7）。

图7. HER2阳性和HER2阴性胃癌基因特征总结

在HER2阳性胃癌中，首先关注两种富集的基因变异：PTEN突变和PTEN缺失。PTEN突变为移码突变p.T319fs以及新型核苷酸缺失p.Q245_P248del，在2例患者中观察到。两者都可能导致PTEN功能缺失，PI3K/Akt通路激活。此外，在9例患者中观察到PTEN缺失。PTEN缺失导致PTEN基因表达水平低。大量研究表明，PTEN阴性肿瘤，包括乳腺癌和胃癌，对曲妥珠单抗无反应。因此，观察到的PTEN突变和缺失可能是HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药的潜在机制。

本研究发现，HER2阳性患者的基因扩增数目显著高于HER2阴性患者，提示基因扩增可能与抗HER2治疗的获得性耐药有关。我们关注HER2阳性患者中富集的CDK12、MET和EGFR扩增。ERBB2和CDK12都位于染色体17q12，是胃癌中高度扩增的区域。与之前的几项研究一致，本研究中，39%的HER2阳性患者同时携带ERBB2和CDK12扩增，如图2A所示。有趣的是，最近的体外实验表明，在乳腺癌中，CDK12驱动曲妥珠单抗耐药，CDK12抑制剂通过PI3K/Akt和Wnt通路增强对抗HER2治疗的敏感性。因此，在胃癌中，CDK12和ERBB2共扩增可能是曲妥珠单抗耐药的潜在机制。此外，已知乳腺癌中癌基因MET和EGFR可激活PI3K/ Akt通路，因此曲妥珠单抗不能完全减轻这种信号传导。胃癌中这些基因扩增也可能影响对抗HER2治疗的反应。

在HER2阴性患者中，我们关注ARID1A突变，这是继TP53突变之后最富集和第二常见的突变。与之前的研究一致，本研究中，大多数ARID1A突变都是失活突变，可导致ARID1A表达缺失。有趣的是，ARID1A与错配修复蛋白MSH2相互作用，ARID1A缺陷可能会增加多种人类癌症类型的突变负荷。此外，ARID1A缺陷型卵巢癌小鼠模型显示突变负荷增加，肿瘤浸润淋巴细胞数目增加，PD-L1表达水平更高。这些数据表明具有ARID1A突变的HER2阴性肿瘤可能是一种“热肿瘤”，鼓励我们进一步探索胃癌中局部免疫环境与HER2状态的相关性。尽管在HER2阳性患者中仅发现2例患者存在ARID1A突变（2/49），具有ARID1A突变的HER2阳性肿瘤与具有ARID1A突变的HER2阴性肿瘤在突变数目和TMB方面没有明显差异。因此，具有ARID1A突变的HER2阳性肿瘤的免疫原性可能与具有ARID1A突变的HER2阴性肿瘤相似。

通路分析显示，几条免疫相关通路与HER2阴性胃癌显著相关，包括PD-L1表达和PD-1免疫检查点通路。此外，与HER2阳性患者相比，HER2阴性患者靶向NGS panel计算的TMB值往往更高，特别是ARID1A突变患者。另外，TCGA全外显子组测序数据集分析表明，ERBB2非扩增胃癌患者具有更高的突变数目、CD8A表达水平和CYT评分。所有这些发现都支持我们的假设，即HER2阴性胃癌是一种相对“热肿瘤”，而HER2阳性胃癌是一种相对“冷肿瘤”。根据我们的假设，HER2阳性胃癌患者可能无法从免疫检查点抑制剂中获益。然而，研究表明，曲妥珠单抗可通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）激活先天性和适应性免疫应答。这被认为是HER2阳性胃癌患者对曲妥珠单抗和免疫检查点抑制剂联合治疗反应更好的原因。

在本研究中，HER2状态和ERBB2扩增的一致性为73.8%，与之前几项研究报告的一致性相似。肿瘤内异质性可能导致HER2状态和ERBB2扩增的差异。本研究有两个局限。首先，临床数据只有在TROX试验的临床分析完成后才能获得。其次，没有进行体内或体外实验来进一步支持我们的假设。未来应通过结合临床和实验数据的基因组分析来验证本研究结果。

已知饮酒是胃癌的危险因素。胃ADH（乙醇脱氢酶）负责人胃细胞中大部分乙醇代谢，形成对口服酒精的代谢屏障。因此，胃ADH可能参与致癌作用，确定ADH在胃癌中的作用将是有趣的。然而，本研究使用的panel未包括ADH。未来应探索胃ADH与HER2状态的相关性。

总之，本研究表明了前瞻性试验中HER2阳性和HER2阴性胃癌患者基因特征的差异。HER2通路的几种基因变异可能是曲妥珠单抗耐药的潜在机制。此外，与HER2阳性胃癌相比，具有ARID1A突变的HER2阴性胃癌可能是对免疫检查点抑制剂有反应的热肿瘤。

参考文献：

Hu Q, Oki E, Yamada T, Kashiwada T, Sonoda H, Kataoka M, Kawanaka H, Tsuji Y, Makiyama A, Nakashima Y, Ota M, Kimura Y, Yoshizumi T. Genomic characterization between HER2-positive and negative gastric cancer patients in a prospective trial. Cancer Med. 2023 Jun 16. doi: 10.1002/cam4.6269. Epub ahead of print. PMID: 37325934.