抗体药物的发展史

1、抗体的发现

抗体药物是生物技术制药领域的一个重要方面。抗体药物的发展并不是一蹴而就的，抗体的发现以及抗体药物的临床应用经历了一段漫长的历史进程。

抗体治疗的最早应用可以追溯到中国人接种“人痘”预防天花的记载算起，国际上一般公认的人痘接种术最早起源于中国公元１０世纪，但据中国的一些史书记载，种痘始于唐朝。１６６１年，随着因得过天花而继承皇位的康熙执政，人痘接种开始从民间走进皇宫，种痘术开始在全国得以提倡和推广。到后来的英国人Jenner受到中国人痘接种法的启示，接种牛痘预防天花，直至今日，免疫学的发展已有三个半世纪。

早在19世纪末，抗体被动免疫疗法的创立为当时不发达的疾病治疗开辟了新途径。Ehrlich提出的侧链学说为免疫学与免疫疗法奠定了基础。19世纪80年代后期，学者们在研究病原菌的过程中，发现白喉杆菌分泌的白喉外毒素有致病性，进而发现在感染者的血清中有“杀菌素”(bactericidins)，这就是最早发现的抗体。

在抗体发现早期，这种特异性的抗体物质勾起了科学家们极大的兴趣，科学家们前赴后继致力于解析抗体的结构，但由于落后的实验条件，进展缓慢。    

1937年瑞典物理学家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通过电泳技术证明了抗体也是一种蛋白质，并将其称为γ球蛋白。

1953年英国生物化学家Frederick Sanger成功解析了同样身为蛋白质的胰岛素的化学结构，从而为科学家们解析抗体结构指明了方向。

1963年，Edelman与RodneyRobert Porter(Sanger的第一个博士研究生)结合两人多年的研究结果，提出了比较成熟 的 “Y”型对称结构 的 抗体分子模型。

1969年，Edelman和Porter完成了一项在当时了不起的成就，他们成功对抗体1300多个氨基酸序列进行了测定，是当时测定氨基酸序列的最大的蛋白质分子。

1976年，日本科学家利根川进和同事 用一系列确凿的实验数据确定了抗体多样性是由B淋巴细胞中抗体基冈的染色体重排和突变造成的。 根据估算，抗体基因通过重组和突变甚至可以编码100亿种不同的抗体，很好解释了抗体多样性产生的原因。

1987年，利根川进由于抗体多样性的突破性研究独享了该年度的诺贝尔生理学或医学奖。

2、抗体的结构和分类

免疫球蛋白Ig由4条多肽链通过链间和链内二硫键连接组成：

两条相同的相对分子质量较大的肽链（称为重链，heavychain，H链，相对分子质量约为55000或70000）和两条相同的相对分子质量较小的肽链（称为轻链，light chain，L链，相对分子质量约为24000）组成。 

让我们把抗体想象成在人的血液里飘浮着的成千上万个双齿的小叉。 

每个小叉的每个齿都可以黏结一个特定抗原的一个特定部位，这样一个双齿叉可以结合两个同样的抗原。 

抗原则可以是外来或病变的蛋白，甚至包括入侵病原体（真菌、细菌、病毒等）的RNA、DNA或多聚糖。

用双齿叉打比方只是一个简化的模型。实际上，抗体分子是很有弹性和柔性的，形状也不是明显的“Y”形。在电子显微镜下它看起来更像三个球堆成的“品”字。抗体是比较大的分子，分子量约在150KD左右，是水分子的8千多倍。它宽约4纳米，长约11纳米。如果把一个血小板细胞想象成一个西瓜那么大的话，那一个抗体分子只有西瓜籽那么大。  

抗体重链类型直接决定了抗体的类型，哺乳动物抗体重链可分为五类，分别以希腊字母γ、α、μ、δ、和ε表示，据此将抗体相应地分为IgG、 IgA、 IgM、IgD和IgE。   α和γ大约含有450个氨基酸，μ和ε约含550个氨基酸；

同时μ链和ε链含有5个肽环，γ链、α链、δ链含有4个肽环。    

IgG是血清中一种主要的Ig，含量占总Ig的65—75%左右。广泛分布于组织液中，血管内、外间隙中分布量大体相当。是机体抗感染的一种重要物质。  

IgM是成熟胎儿合成的第一类Ig，也是在感染或免疫后最早产生的Ig，5类Ig中IgM最强，故其细胞毒活性和细胞溶解活性也最强。天然的血型抗体是IgM，有些自身抗体如抗磷脂抗体、RF等也属于IgM。胎儿脐血中IgM抗体升高，是胎儿遭受感染的标志。  

IgA在血清和组织液中的含量相对较少，血清型IgA含量占总Ig的15—25%，但在外分泌液如初乳、唾液、眼泪、肠道分泌液和支气管分泌液中含量较高。由于IgA主要存在于外分泌液中，故在第一线抗感染防御中起重要作用。  

IgE为单体结构，是正常人血清中含量最少的Ig。IgE在血清和组织液中含量极微，其主要生物学功能是与组织肥大细胞、嗜碱粒细胞表面的特异受体结合。IgE不能激活补体。IgE含量在正常人群波动较大，在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。当变态反应原与结合在受体上的IgE反应时，可引起肥大细胞、嗜碱粒细胞脱颗粒，释放出组织胺、5—羟色胺等生物活性物质。  

IgD在正常人血清中IgD浓度很低，几乎检测不到。IgD主要存在于人B淋巴细胞表面作为抗原的细胞受体，在血清中IgD含量极微且与膜结合的IgD有不同结构。B细胞上IgD的可变区与该细胞将分泌的IgG、IgA、IgM的可变区相同，当抗原与IgD受体结合时，刺激B细胞繁殖、分化、并分泌对抗原特异的其他类抗体

3、治疗性抗体的发展阶段

自1986年第一个治疗性抗体进入临床以来，治疗性抗体得到了迅速的发展，到目前为止，FDA共批准了近百个治疗性抗体药物，其已成为现代生物医药的重要组成部分。伴随现代科技的发展，治疗性抗体经历了鼠源性抗体，嵌合抗体，改性抗体和表面重塑抗体（部分人源化抗体），以及全人源化抗体等不同发展阶段。 

第一代：鼠源单抗（momab）

1986年，也就是在Milstein和Kohler凭借单抗杂交瘤技术获得诺贝尔奖后的第二年，强生的Orthoclone  OKT3成为第一个被美国FDA批准的单抗药，用于防止肾脏移植后的宿主排斥。但直到9年以后，第二个抗体药——礼来和强生的ReoPro——才于1995年在美国上市，被用来抑制血栓形成。 

第一个单克隆抗体药Orthoclone  OKT3来自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人服用过程中常常遇到一些问题：1）人体把这些单抗药当作异体蛋白，会产生免疫排斥。2）免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉，大大降低了它们应有的疗效。尤其治疗慢性疾病需要长期服用的情况下，鼠源单抗药在后续注射时疗效甚微；3）少数病例中，鼠源抗体会引起严重的过敏反应，甚至导致了个别病人的死亡。

第二代：人鼠嵌合单抗（ximab）和人源化单抗（zumab）

这里我们有必要区分一下人源化抗体和人源抗体。人源化抗体一般是以鼠源抗体为基础，通过更换蛋白片断和置换部分氨基酸序列， 使抗体的最终氨基酸序列更接近人源的。而人源抗体是任何能被人体B细胞表达的抗体，其氨基酸序列是100%由人的基因编码的。

20世纪90年代，以研发抗体药为主的公司在当时的江湖上分两大流派。第一个流派可以称之为抗体蛋白工程派或人源化派。单抗在小鼠中产生后，它的部分氨基酸序列或被置换，或被拼接组合，其最终目的是既不引起人的免疫排斥，又不降低它对靶抗原的亲和性。这一流派又分为两个层次。第一个层次是嵌合抗体（Chimeric  antibody）:  抗体的恒定区都被置换成人的氨基酸序列。嵌合单抗蛋白约33%的氨基酸序列来自小鼠，其余67%为人源的。第二个层次是人源化抗体(Humanized antibody)，即拿到针对某抗原的小鼠抗体后，只取其识别抗原的几段区域（CDR区域），把它们移植到人源抗体中。人源化单抗中人源的序列占90%。人源化单抗显然比嵌合单抗更有优势，引起免疫排斥或超敏的风险更低。人源化单抗技术的代表公司为Protein Design Labs, 或PDL。基因泰克几个著名的单抗药——Herceptin, Xolair和Avastin——的人源化都需要获得PDL的技术许可。

人源化单抗技术最大的缺点是缺乏通用的方法。每个抗体分子的人源化，都需要个案分析、分子建模、大量的改造和试错。即使这样，由于鼠源序列的存在，人源化单抗还是不能完全避免免疫排斥或超敏的风险。

第三代：全人源化单抗（mumab）

抗体药的第二个流派是全人源单抗。这一流派又分为两大门派：噬菌体展示和转基因小鼠。            

用噬菌体展示技术产生抗体完全避免了动物的使用。在这一技术中，先通过PCR技术建立一个以噬菌体质粒为载体的、表达无数个人源抗体可变区的基因库。当大肠杆菌被这些质粒转染后，千百万个噬菌体被释放出来。每个噬菌体表面呈现一个独特的抗体可变区片断。含有这些噬菌体混合物的溶液，在流过附着特定抗原的固态基质后，粘在基质表面、洗不走的往往是呈现特异性抗体的噬菌体颗粒。特异性抗体的基因再进一步被扩增、纯化。这一流派的代表公司包括CAT和Dyax。

转基因小鼠技术出道虽晚，但技术优势却最为明显。该技术通过转基因的手段把小鼠自身的抗体表达系统破坏掉，再引进人的抗体生成系统。这种转基因小鼠针对某种抗原就可以直接产生全人源的抗体。

噬菌体展示和转基因小鼠在执行过程中各有千秋。一般来说，噬菌体展示技术“先快后慢”，即找到针对某种靶蛋白的抗体很快，但选出的这个抗体和靶蛋白的亲和性往往不高，需要人工细调，更换个别氨基酸。优化这一步费时费力，而且即使优化的抗体和通过转基因小鼠出来的抗体相比，亲和力可能还是相差一个数量级。另外，在优化的过程中需要替换一些氨基酸，也就引进了被免疫排斥的风险。转基因小鼠技术是“先慢后快”，将抗原注射到小鼠体内、产生特异抗体、制备杂交瘤细胞等前几步需要几个月的时间。但一旦最初的抗体产生，其优化过程在小鼠体内继续完成，又快又好，并且不用担心免疫排斥的问题。

4、抗体的筛选技术

随着抗体药的需求越来越大，抗体筛选技术的发展也是日新月异，目前应用较普遍的有杂交瘤技术、抗体文库筛选技术、B细胞克隆技术和转基因小鼠抗体筛选技术。

杂交瘤技术

杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术，是在体细胞融合的技术基础上发展而来的。这项技术将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，利用杂交瘤细胞可以大量的生产单克隆抗体。

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

除了噬菌体展示技术之外，基于文库展示的技术还包括：酵母展示技术、核糖体展示技术以及细胞展示技术等。

B细胞克隆技术

经过 B 淋巴细胞表面标记物和抗原特异性筛选，可以获得针对特异性抗原的单个 B 淋巴细胞，然后通过分子生物学手段从中获得编码抗体 IgG 的重链和轻链基因，并在体外重组表达验证，是目前获得单克隆抗体最有效和快速的技术。

基于单 B 细胞筛选的抗体发现技术发展，还得益于流式细胞技术、微流控技术（Microfluidic）以及光流体技术（Optofluidic）等相关生物技术的发展和成熟，使其成功的从实验室走向商业化应用，并在单克隆抗体特别是治疗性单克隆抗体的开发方面被广泛应用。

基于单 B 细胞分选技术的单克隆抗体开发平台，和传统的单克隆抗体开发平台相比，最突出的优势在于能够从人体内直接筛选获得全人源单克隆抗体；同时，也能够大大缩短研发周期，从获得康复病人的外周血淋巴细胞开始，一般来说在 4-6 周内即可获得全人源单克隆抗体，并完成相应的生物学功能实验（如病毒结合和中和实验、ADCC 实验等）；并且由于所获得是全人源单克隆抗体，可以大大简化甚至于不需要抗体人源化改造工程，快速推进至临床试验。　　

转基因小鼠全人源抗体筛选技术

早在1985年，Alt等人就曾提出可以应用转基因技术得到具有人源序列的单克隆抗体。1989年，Bruggemann等人在小鼠中表达了人源重链，从而产生了转基因编码的免疫应答。而在1994年，Lonberg和Jakobovits的团队分别采用了不同的方法构建了能够表达人源抗体的转基因小鼠。Lonberg利用了核内显微注射的方法，而Jakovovits用的是酵母人工染色体（YAC）的方法。重链包含3个重链可变区（VH），16个D，所有的6个JH区。 Abgenix的XenoMouse®是第一个同时有大部分人源VH和人源Vκrepertoire的转基因小鼠品系。2005年，安进以22亿美元收购Abgenix。XenoMouse平台上开发出的第一个单抗药物是Abgenix和安进共同开发的抗EGFR单抗panitumumab（于2006.9被FDA批准），这也是基于转基因小鼠的第一个全人源单抗药物。

小结

抗体药物从发现到进入临床应用，经历了曲折而又漫长的历程。在这段时间里，人们对于抗体药物的认识发生了巨大的变化。在过去的十年里，抗体已经成为医药市场上最畅销的药物。预估 2023 年全球十大畅销的药物中，就会有 5 个抗体类药物。因此，随着抗体类药物被批准用于治疗各种包括癌症、自身免疫、代谢和传染病，治疗性抗体药物的市场必会呈现爆炸式增长的态势。

来源：生物药学科普 2023-02-20

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