综述 | 基于血液样本的转录标识物在结核病诊断中的研究进展

文章来源：中国防痨杂志, 2023, 45(8): 801-807 

doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20230182

作者：贝呈, 李蒙, 高谦

作者单位：复旦大学基础医学院教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

通信作者：高谦

摘要

开发便捷、快速、准确的结核病诊断技术是终止结核病的重要一环。现有检测方法存在痰液样本采集困难等问题，而基于血液样本的转录标识物的检测方法有望弥补这些缺陷。本文综述血液转录标识物在结核病诊断中的研究进展及其应用，探讨其局限性与未来发展方向。

关键词：结核; 诊断; 转录因子; 生物学标记

目前，全球范围内临床诊断的结核病患者中仅63%具有细菌学证据，表明现有结核病诊断方法仍存在缺陷。结核病诊断主要依赖于对结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 的检测，例如痰涂片抗酸杆菌染色与痰培养。随着分子诊断技术的发展，通过对MTB基因组片段的核酸扩增检测实现结核病的诊断，如目前世界卫生组织 (World Health Organization, WHO) 推荐的GeneXpert MTB/RIF和环介导等温扩增技术等方法，凭借其快速且高敏感度和特异度的优势已逐渐代替传统痰涂片检测。

尽管快速分子诊断技术已比较成熟，然而这些方法均依赖于痰标本。一些患者无痰或少痰，特别是儿童患者和HIV感染者的痰标本难以获得。痰标本质量对检测结果也有很大影响。而且，对于肺外结核，由于取样困难，且样本中MTB载量较低，使传统方法的敏感度降低。这些因素制约了该技术的广泛应用。因此，WHO提出优先发展基于非痰样本的结核病诊断技术。目前，基于非痰样本和非MTB菌体的结核病诊断主要通过检测尿液或血液中MTB特有的标识物，如脂阿拉伯甘露聚糖、游离DNA等。然而，这些技术尚未成熟，正在优化完善中。

转录组学技术为发现用于结核病诊断的生物标识物带来了新的方向。借助微阵列 (microarray)、RNA测序 (RNA-seq) 等平台，获得不同疾病状态下宿主基因表达谱，筛选特定的差异表达基因，经临床验证后，得到一组由一个或多个基因组成的转录标识物，以鉴定特定的疾病状态。与其他生物标识物相比，转录标识物的检测具有突出的优势：（1）通常采用获取最便捷的样本类型——血液样本；（2）容易与现有快速分子检测平台整合，临床转化难度较低。比如，诊断结核病的转录标识物基因GBP5、DUSP3和KLF2已经整合于美国赛沛公司 (Cepheid) 开发的GeneXpert平台 (Xpert-MTB-HR-Prototype)。目前，转录组学技术在检测结核病、鉴别结核病与结核分枝杆菌潜伏感染、预测结核分枝杆菌潜伏感染者发病风险、监测治疗效果并预测治疗结局等多方面显现出良好的潜力。其中，用于结核病诊断的转录标识物的研究最为广泛，且最接近临床应用。因此，笔者聚焦于结核病诊断的转录标识物，将从筛选方法、诊断效果、临床应用及存在问题等方面进行综述。

一、筛选血液转录标识物的基本策略

血液转录组是对血液样本中RNA水平的全局无偏测定，通过检测转录组中的mRNA，能够同时准确测量宿主几乎所有基因的转录表达情况。因此，基于血液转录组能够区分不同生理和病理状态人群的差异表达基因，发现其表征的生物标识物。血液转录标识物的筛选策略大同小异，其主要流程为：

（1）明确临床患者分组，严格执行患者纳排标准，用恰当的采样管采集患者血液并妥善保存。

（2）处理血液样本，根据是否对血液进行成分分离，可分为全血样本及成分血样本；根据血液样本是否使用MTB抗原刺激，可分为抗原刺激样本和未刺激样本。目前，血液转录标识物研究大多使用未经MTB抗原刺激的全血样本。

（3）获得血液转录组数据，分析鉴定特定患者与其他人群显著差异表达的候选基因。

（4）利用数学模型和机器学习等方法优化筛选流程，在不影响鉴别能力的前提下尽量减少候选基因数，并最终筛选出由较少基因组成的基因集，即转录标识物。

（5）利用新的临床队列数据验证转录标识物，检测其敏感度和特异度等指标，评估转录标识物的诊断效能。尽管筛选鉴定的流程大致相同，但不同研究在临床队列的选择、基因筛选方法等存在差异，最终得到的转录标识物及其诊断效果也不尽相同。

二、结核病诊断的血液转录标识物的研究现状

（一）现有结核病标识物概况

从Mistry等2007年首次通过分析结核病患者和结核分枝杆菌潜伏感染者的血液基因表达微阵列鉴定了9个基因标识物以来，转录组技术已被广泛运用于结核病标识物的筛选与鉴定。目前关于结核病标识物的研究超30项，其中，在非洲收集的转录组数据最为丰富，涉及的国家与地区主要包括南非、马拉维和甘比亚，发现的标识物基因近400个。不同研究鉴定的标识物包含的基因数量差异很大，一些研究筛选的标识物基因超100个。例如，Walter等筛选出119个标识物基因用于区分结核病与肺炎或结核分枝杆菌潜伏感染；而一些研究发现单基因便可以鉴别结核病与其他人群，这些基因包括BATF2 (basic leucine zipper ATF-like transcription factor 2)、FCGR1B (Fc fragment of IgG receptor 1b)、ADM (adrenomedullin)、NPC2 (NPC intracellular cholesterol transporter 2)、UBE2L6 (ubiquitin conjugating enzyme E2 L6)。此外，不同研究筛选的标识物基因也有很大差别，仅1/4左右的标识物基因在不同研究中存在重叠，出现频率高于5次的基因仅3个，分别为GBP5 (guanylate binding protein 5)、GBP6 (guanylate binding protein 6)和C1QB (complement C1q B chain)。

（二）发现的标识物基因多与宿主免疫相关

目前发现的标识物主要集中在与宿主免疫相关基因。例如，Roe等利用稳定性选择 (stability selection) 和基于支持向量机 (support vector machine, SVM) 模型发现利用基因BATF2、GBP5、SCARF1 (scavenger receptor class F member 1) 能够准确地区分结核病患者和健康人群[曲线下面积 (area under curve, AUC) 为0.96]，其中，BATF家族与干扰素调节因子 (interferon-regulatory factor) 的相互作用对人体免疫网络起重要的调控作用，GBP家族基因能够被干扰素诱导表达，而SCARF1则参与凋亡细胞的清除；Kaforou等利用弹性网络算法筛选出了27个用于鉴别结核病患者与结核分枝杆菌潜伏感染者的标识物基因，包括补体 (C1QB、C1QC、C5)、趋化因子受体 (CCR6、CXCR5) 和Fc gamma受体 (FCGR1A、FCGR1B) 基因等。近几年，单细胞测序技术也参与结核病标识物的鉴定当中。例如，Xu等利用公开转录组数据集，通过加权基因共表达网络 (weighted gene co-expression network analysis) 和蛋白质互作网络 (protein-protein interaction networks) 方法鉴定了参与结核病免疫响应的3个关键基因ADM、IFIT3和SERPING1，通过单细胞测序发现髓系细胞ADM的上调表达仅发生在结核病患者，提示该基因是一个潜在转录标识物，进一步发现全血样本中的ADM在区分结核病和健康人群时AUC可达0.786~0.899，具有一定鉴别能力。国内也开展了相关研究，例如，2022年刘艳华等发现基于FCGR1B的mRNA表达水平可用来检测肺结核与肺外结核，AUC分别达0.849和0.906。在目前发现的标识物基因中，有些基因在多个研究中均被发现。例如，Roe等筛选出的BATF2同时也在由Zak等鉴定的16个基因标识物中；出现频率最高的是GBP5，在7项研究中都被发现，其家族的其他成员 (GBP1~GBP6) 也被多项研究作为结核病患者的标识物。分化簇 (CD) 基因也是一类常见的转录标识物，包括CD1C、CD36、CD46、CD74、CD177、CD226等。这些基因的差异表达可能反映了血液中免疫细胞数目的变化。例如，CD177作为中性粒细胞的表面抗原，其在结核病患者血液中的表达较其他相似症状的非结核病患者明显降低，这与结核病患者血液中性粒细胞数目少于其他患者的结果一致。然而，这些免疫相关标识物并非结核病特有。例如，BATF2也是判断胃癌患者是否能够受益于免疫治疗的标识物。而过去研究认为宿主针对结核病的响应更接近自身免疫病。例如，结核病患者与结节病患者的血液转录组有90%左右的差异表达基因是一致的，对于余下10%“结核特异”的基因主要参与结构蛋白的翻译，而这些基因本身也并非只在结核病患者中差异表达。

此外，也发现了一些结核病标识物为非免疫相关基因。例如，钾离子电压门控基因KCNC4，以及钾离子内向整流通道基因KCNJ13和KCNJ15，均在多个研究中被发现，其中，结核病患者在钾离子通道基因上组蛋白乙酰化修饰使KCNJ15过表达，其与细胞凋亡增加有关，可能是MTB感染导致的宿主保护性响应；醛脱氢酶基因ALDH1A1是另一种非免疫标识物基因，其高表达与多种疾病相关，包括肿瘤、糖尿病、肥胖等，该基因在结核病中的机制尚不明确。总之，目前发现的结核病标识物大多与宿主抗结核免疫相关，但并非结核病所特异；同时，标识物也包含了一些非免疫相关基因，其具体机制尚不明确。

（三）结核病转录标识物的应用现状

对于结核病筛查和确诊检测方法，WHO有明确的标准：对于筛查 (triage test)，最低标准为敏感度>90%，特异度>70%；对于确诊 (confirmatory test)，最低标准为特异度≥98%，同时在敏感度上有一定要求 (表1)。尽管目前发现的结核病转录标识物基因多达上百个，但按WHO的标准，这些标识物的实际诊断效果却不尽如人意。例如，南非一项针对现有转录标识物对成年人结核病诊断效果评估的前瞻性队列研究发现，纳入的27组转录标识物中，仅2组 (Sweeney3、Roe3) 达到了WHO设定的最低结核病筛查标准，没有一组标识物达到最低确诊标准。由Sweeney等基于10个国家或地区、14个公开的RNA-seq和微阵列数据集分析得到的、整合GBP5、DUSP3和KLF2等3个基因表达水平的转录标识物是目前唯一已经商品化的检测试剂盒 (Xpert-MTB-HR-Prototype)，该试剂盒在多项前瞻性队列研究中达到了WHO设定的最低筛查标准。例如，一项纳入了南非、甘比亚、乌干达和越南疑似肺结核患者的研究发现，该标识物检测的敏感度和特异度分别为90%和86%；另一项在南非开展的前瞻性队列研究中，该标识物检测的敏感度和特异度分别为90%和75.6%。但也有一些队列研究的结果不佳。在一项巴西监狱人群的研究中，该标识物的敏感度为90%，特异度仅为53%；另一项英国的前瞻性队列研究中，其敏感度与特异度均不高，分别为78%和76%。这些结果表明，实际应用中，现有转录标识物用于诊断结核病患者的效果并不理想，而用于结核病患者筛查方面，在部分队列研究中达到了WHO的最低标准。

（四）影响转录标识物诊断效果因素

尽管已经开展大量的用于结核病诊断的转录标识物研究，也发现了诊断效果相对较好的标识物 (如Sweeney3)，但在实际应用中的表现却差强人意，是什么原因导致了这样的结果?

首先是患者体内的MTB载量。Dupnik等分析并发现了患者痰液菌载量与转录标识物诊断效果的相关性，即随着菌载量的升高诊断效果更好，提示宿主免疫反应与患者体内菌载量呈正相关。在巴西监狱人群的研究发现，在转录标识物的特异度设定为70%时，GeneXpert MTB/RIF结果为阴性或极低的患者中，其敏感度仅为69.0%；在低菌载量患者中敏感度为78.6%；而在中/高菌载量患者中敏感度可达96.8%。菌载量可能受患者就诊意识、疾病严重程度和实验室检测水平等多种因素影响，从而导致标识物的检测效果不同。如一个地区患者的就诊意识不强，延误就诊，患者体内的菌载量往往较高，标识物评估的效果会较好；而在主要以体检方式发现结核病患者的地区，其患者病情较轻，菌载量较低，标识物评价效果可能较差。笔者提到Sweeney3在多项评估中表现较好，这些评估主要在南非、冈比亚、乌干达等非洲地区开展；而在英国的研究中则未达到WHO筛查标准，这可能是两地患者在菌载量与疾病程度上的差异所致。

其次，人群种族背景、疫苗接种情况、菌株谱系等都是影响转录标识物结核病诊断效果的潜在因素。人种方面，Nahid等比较了来源于健康菲律宾人、中国人及非西班牙裔白人的巨噬细胞对lineage 1、2、4谱系的MTB的免疫响应，发现菲律宾人的巨噬细胞在所有谱系MTB刺激下都产生较少白细胞介素 (interleukin, IL) -1、IL-6及较多的IL-8；而中国人的巨噬细胞在lineage 4 (CDC1551和H37Rv) 刺激下较菲律宾人和白人产生了较高水平的肿瘤坏死因子α。疫苗接种方面，由于各地经济与卫生水平不同，各地区的疫苗接种率也有较大差异。卡介苗接种能够诱发人体产生训练免疫 (trained immunity)，并减轻系统性的炎症反应，从而改变宿主针对MTB的转录响应。菌株谱系方面，感染不同亚型的菌株可能会导致宿主不同的免疫响应。例如，在全球广泛分布的lineage 2型菌株被认为具有更高的毒力及耐药水平，多项研究均提示该谱系菌株与其他谱系菌株相比能够诱导宿主巨噬细胞及小鼠Ⅰ型干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素等细胞因子的差异表达。对于另一种全球流行的亚型lineage 4，Ranaivomanana等发现感染该亚型菌株患者的全血样本在结核菌素纯蛋白衍生物刺激下产生的γ-干扰素和IL-2水平明显低于感染lineage 3型的患者。这些结果可能导致细胞因子相关的转录标识物在不同菌株背景下的差异。除了不同谱系的影响，即使是同一谱系下的不同亚群，在诱导宿主免疫上仍可存在差异。例如，lineage 2谱系下的现代亚型菌株能够诱导宿主产生更强烈的炎症反应。这些结果提示不同的菌株谱系可能会造成标识物基因筛选的差异。然而在现有的转录标识物研究中，这一因素往往被忽略，菌株谱系对患者转录组的影响仍有待系统地研究。值得注意的是，以上影响因素并非独立存在，而是往往呈现出地域性，即：一个地区在人种、菌株背景、疫苗接种情况，甚至是患者菌载量都有其各自的特点。目前，全球范围内已有多个关于结核病转录标识物的前瞻性队列研究，涵盖了非洲、欧洲、美洲、亚洲等。尽管这些队列覆盖了不同地区，但一些地区却受到了更多“青睐”。例如，在非洲开展的研究较多，在南非就有9个队列研究，其数据被9项研究所使用。因此，这一地区宿主与细菌背景因素导致的偏倚也可能被放大。

此外，研究设计、采样方法、组学技术、数学模型也都会影响结核病转录标识物的评价效果。在研究设计方面，不同队列纳入的受试者的年龄段、免疫背景 (如HIV感染状态)、疾病状态 (如是否合并其他疾病) 不同，且对结核病患者的定义也存在差异；在采样方法上，PAXgene和Tempus血液RNA试剂盒是最常用的采血管，两者是否存在系统性差异目前仍未知，且后续的RNA分离与提纯方法在不同研究中也有一定区别；在组学技术上，微阵列是早期研究最常用的方法，随着二代测序技术的普及，RNA-seq几乎完全替代了微阵列，两者的基因转录本定量结果有一定差异，且与实时荧光PCR结果的相关性也不同。最后，机器学习模型在筛选标识物时被广泛使用，其本身具备“黑箱”特征，有一定复杂性与低可解释性 (interpretability)，通过这种方式筛选出来的基因往往隐含了研究设计中地理、人口、菌株等因素的潜在偏倚。

三、对转录标识物应用前景的思考

利用宿主血液转录标识物诊断结核病具有不依赖于痰液样本、快速便捷、容易与现有快速分子检测平台整合等优势，具有良好的应用前景。然而在实际应用中，目前的标识物都未达到WHO的确诊标准，少数标识物则达到了筛查标准。下面是笔者关于转录标识物应用的几点思考和建议：

第一，转录标识物缺乏特异性。目前结核病诊断以病原学证据为标准，采用的分子标识物均为MTB特有的成分，例如特异的核酸片段、蛋白质或代谢物等，而转录标识物主要为宿主免疫相关基因。与检测适应性免疫产生的针对MTB特异抗原的特异性抗体不同，转录标识物所检测的免疫响应与许多亚急性或慢性损伤反应有很大重叠。因此，转录标识物在理论上难以用于结核病的诊断，且实际评估结果也佐证了这一观点。如Wang等评估了已发表的19组转录标识物在24个独立的结核病队列研究中的诊断表现，发现区分结核病与其他疾病相较于区分结核病与健康人或结核分枝杆菌潜伏感染者，其效果普遍较差。

第二，转录标识物适合做筛查。结核病控制的关键是发现患者，发现患者的方式分为两种，一种为被动发现，即对来到医疗机构的疑似结核病患者进行诊断；另一种为主动发现，即在高发病率地区对普通人群或在中低发病率地区对高危人群进行筛查，对筛查阳性患者进行进一步确诊。根据WHO设定的目标，以上两种患者发现方式的诊断标准有明显差异，前者要求极高的特异度；而后者更注重敏感度，特异度可以较低 (表1)。而转录标识物的研发大多以被动发现为主要目的，对主动发现这一控制结核病传播的重要途径却很少关注。目前，结核病筛查方法缺陷明显，如通常的症状筛查敏感度低，遗漏了50%~60%的患者；而敏感度高的胸部X线摄影筛查可及性差，难以推广；GeneXpert MTB/RIF作为筛查方法成本高 (即使采用混检方式)，通量低。而基于血液的转录标识物不依赖于痰液，样本获取便捷；通过集中收集血液样本统一进行荧光定量检测，可以大幅降低检测成本，有望成为经济、简便的结核病筛查方法。

第三，转录标识物用于筛查的效果需要更多的评价。目前对结核病转录标识物的评估研究主要集中在对其诊断效果的评价，而对其作为筛查方法的敏感度评价还很少。在已有的研究中，结核病患者通常是来医疗机构就诊的疑似患者，其菌载量往往高于在人群中筛查发现的结核病患者。因此，尽管目前的研究发现转录标识物作为筛查的敏感度可以达到WHO的标准，但仍然需要在大范围的人群筛查中评估其实际效果。

有鉴于此，笔者对推进转录标识物应用提出几点建议：（1）加强国内开展结核病转录标识物的研究，丰富我国结核病患者的转录组数据，筛选适用于我国结核病患者的转录标识物；（2）进一步优化研究设计，统一不同患者群体的分类标准，以及标准化检测流程，提升转录标识物的稳定性；（3）吸引企业开发转化基于转录标识物的检测技术，特别是适用于较大规模人群筛查的技术；（4）加强实施性研究,发现和解决转录标识物检测技术在应用过程中的问题，使该技术真正在我国结核病防控工作中发挥作用。

综上所述，笔者综述了血液转录标识物的原理与研究现状，指出现有转录标识物总体诊断效果不佳，可能受菌载量、宿主免疫背景及研究设计等因素影响；更重要的是，转录标识物特异度低，难以作为结核病诊断工具，但其具有较好的敏感度，在多项评估工作中达到了WHO制定的结核病筛查标准，且该方法不依赖于痰液，具有研发出简便、经济、高通量检测方法的潜力，在结核病筛查中具有良好应用前景。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献 贝呈：采集数据、分析/解释数据、起草文章；李蒙：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；高谦：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导、支持性贡献

参考文献略

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编辑：孟莉

审校：范永德

发布日期：2023-08-22

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