银杏内酯注射液对脑缺血再灌注损伤治疗时间窗及凋亡信号通路影响

治疗时间窗是指脑缺血后药物治疗能减轻损伤程度、促进机能恢复以及改善长期预后的一段时间范围。卒中往往发病突然、治疗时间窗窄，给临床治疗带来重大挑战。前期研究发现，银杏内酯注射液（GI）具有治疗缺血性卒中的作用，作用机制与减轻神经血管单元的损伤有关。本研究旨在探讨GI对大脑中动脉短暂阻塞再灌注（tMCAO）模型大鼠的有效治疗时间窗以及其对凋亡信号通路的影响。

材料与方法

采用Longa法制备大鼠tMCAO模型。

分别于再灌后1、3、6、9 h腹腔注射（ip），首次给予GI（2.5 mg/kg），每天2次，连续3 d，通过神经功能评分、脑梗死体积及脑组织含水量评价动物缺血损伤程度。

于再灌注后1 h ip给予GI（2.5 mg/kg），每天2次，连续3 d，分别于再灌注后24、72 h取脑检测缺血半影区p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3蛋白表达水平。

结果

1. GI对治疗时间窗的影响

tMCAO模型是模拟脑缺血再灌注损伤的经典动物模型，缺血致使动物体质量减轻，活动减少，缺血对侧肢体偏瘫等症状。

如图1所示，模型大鼠神经功能受损，脑组织水肿，TTC染色结果显示脑组织大面积梗死；GI给药在一定时间窗内能显著改善脑缺血大鼠损伤，与模型组比较，再灌后1、3 h给药组神经功能评分显著降低（P＜0.05、0.01），梗死体积显著缩小（P＜0.01），脑组织含水量显著减少（P＜0.05、0.01），6、9 h给药组症状略有改善，但无统计学意义。

2. GI对凋亡信号通路的影响

再灌注24、72 h后，各处理组缺血半影区凋亡相关蛋白表达如图2所示。基础状态下，GI对大鼠脑组织胞浆内p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3蛋白表达无显著影响。tMCAO模型缺血再灌后24、72 h半影区组织细胞胞浆内p53、Bax、Caspase 3成熟体蛋白表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降（P＜0.01、0.001），表明凋亡信号通路激活。给予GI显著抑制P53、Bax、Caspase 3蛋白表达的上调，同时抑制Bcl-2蛋白水平的下降（P＜0.05）。结果提示，GI参与抑制tMCAO所致凋亡信号通路的激活，发挥神经保护作用。

讨论

本实验结果显示，再灌注后1、3 h给予GI可显著改善模型大鼠缺血损伤，表现为改善神经功能、减少脑梗死体积及降低脑含水量等作用；再灌注后6、9 h给予GI对脑缺血损伤修复作用不明显，表明GI对tMCAO模型大鼠的有效治疗时间为再灌注后3 h内，提示临床上在卒中发病早期或溶栓再通早期用药疗效更佳。

凋亡是细胞的程序性死亡，是生物体维持正常生长发育的重要机制；按照激活形式的差异，凋亡分为外源性死亡受体信号通路和内源性信号通路，涉及多种基因的激活与蛋白的表达。在内源性通路中，Bcl-2家族促凋亡成员Bax在线粒体膜上形成寡聚体通道，导致细胞色素C外流参与凋亡复合体的形成，并最终激活caspase 3，caspase 3作为凋亡的执行者之一，参与细胞骨架蛋白的撤除与DNA的剪切；Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2通过与BH3结构域蛋白结合抑制内源性凋亡信号的启动；p53作为重要的肿瘤抑制蛋白和转录因子，可在缺血缺氧刺激下直接诱导凋亡蛋白基因的表达（转录依赖机制），亦可作为蛋白分子独立的与抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL结合，促进线粒体细胞色素C的形成。缺血造成的神经元死亡是细胞坏死和凋亡的共同结果，缺血使各种钙通道开放，大量Ca2+内流可通过激活钙蛋白酶Calpains调节凋亡通路中Bid蛋白表达最终促进凋亡通路的激活。

本研究结果显示，模型组促凋亡蛋白p53、Bax与caspase3表达大量增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达量降低，表明缺血半影区凋亡信号通路的激活是导致神经损伤的潜在因素之一；GI治疗24与72 h后，凋亡蛋白p53、Bax与caspase 3表达均显著下调，抑凋亡蛋白Bcl-2显著上升，表明GI可通过抑制凋亡信号通路的激活发挥神经保护作用。

综上所述，GI具有改善脑缺血损伤作用，在卒中溶栓再通后尽早使用可提高疗效，其作用机制与抑制凋亡信号通路的激活有关。

文献来源：

刘科，鄢云彪，丁建花，等. 银杏内酯注射液对脑缺血再灌注损伤治疗时间窗及凋亡信号通路的影响[J]. 药物评价研究，2018,41（7）：1169-1173.

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