重磅科研丨NAT MED(IF:82.9): 粪便菌群移植联合抗PD-1免疫疗法治疗晚期黑色素瘤

编译：微科盟蔚蓝

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

粪便微生物群移植(FMT)是难治性黑色素瘤患者克服对免疫检查点抑制剂耐药性的潜在策略；但FMT在一线治疗中的作用尚未得到评估。本研究在20例此前未经治疗的晚期黑色素瘤患者中进行了一项多中心I期试验，将健康供体FMT与PD-1抑制剂纳武单抗或派姆单抗联合使用。主要终点是安全性。单独使用FMT未报告3级不良事件。5名患者(25%)在联合治疗中出现3级免疫相关不良事件。关键次要终点是客观缓解率、肠道微生物组组成的变化以及系统免疫和代谢组学分析。客观缓解率为65%(13/20)，其中4例(20%)完全缓解。纵向微生物组分析显示，所有患者都移植了来自各自供体的菌株；然而，在应答者中，供体和患者微生物组之间的获得相似性随着时间的推移而增加。应答者在FMT后经历了免疫原性增强和有害细菌减少。Avatar小鼠模型证实了健康供体粪便在提高抗PD-1疗效中的作用。本研究结果表明，来自健康供体的FMT在一线治疗中是安全的，值得进一步研究与免疫检查点抑制剂的联合使用。

论文ID

原名：Fecal microbiota transplantation plus anti-PD-1 immunotherapy in advanced melanoma: a phase I trial

译名：粪便菌群移植联合抗PD-1免疫疗法治疗晚期黑色素瘤：I期试验

期刊：Nature Medicine

IF：82.9

发表时间：2023.7

通讯作者：Saman Maleki Vareki

通讯作者单位：加拿大韦仕敦大学

DOI号：10.1038/s41591-023-02453-x

实验设计

结果

1.试验设计和入组  

共有28例晚期皮肤黑色素瘤患者接受了资格评估，其中2019年6月19日至2021年9月14日期间入组了20名患者。纳入标准包括确诊为不可切除或转移性皮肤黑色素瘤(BRAF野生型或突变型)并且既往未接受抗PD-1治疗的患者。排除持续使用抗生素或益生菌以及存在FMT给药的绝对禁忌症的患者(纳入和排除标准见方法)。在使用聚乙二醇泻药进行肠道准备后的第二天和一线抗PD-1治疗(派姆单抗或纳武单抗)前1周，参与者通过口服胶囊接受了来自健康供体的单剂量FMT的联合治疗(图1a)。三名中位年龄为35的健康筛查男性捐献者分别为4、7和9名患者提供粪便。研究入组时患者的中位年龄为75.5岁(48-90岁)，其中12名(60%)为男性。19例(95%)患者的东部肿瘤协作组(ECOG)表现状态为0-1。总体而言，18例患者(90%)为IV期，其中脑转移3例(15%)，基线血清乳酸脱氢酶(LDH)升高4例(20%)。一名患者在3个月后因肺炎而停用既往的辅助派姆单抗，在最后一次给药14.1个月后复发，经主要研究者审查后该患者获准进入研究。表1总结了患者的基线特征。截至数据截止日期(2022年12月15日)，中位随访时间为20.7个月(7.5-42.3)，6名患者(30%)仍在接受抗PD-1治疗。FMT治疗的中位时间为11.8个月(1.4-24.4)。在FMT联合抗PD-1治疗之前，没有患者接受晚期黑色素瘤的一线BRAF联合或不联合MEK抑制剂治疗。接受纳武单抗或派姆单抗患者的数量相同。

图1.FMT联合一线抗PD-1治疗的临床结局。

a，试验设计纳入了20名接受一线抗PD-1的黑色素瘤患者，他们在开始抗PD-1单药治疗前至少1周接受了一位健康志愿者供体的口服胶囊单次FMT。在四个时间点收集样本，包括基线(S1)和FMT后1周(S2)、1个月(S3)和3个月(S4)。

b，根据RECIST v.1.1标准确定的缓解程度，蜘蛛图显示了从基线到FMT后靶病变大小随时间的变化。CR或PR患者显示为蓝色，SD≥6个月显示为绿色，PD或SD<6个月显示为红色。

c，Swimmer图显示了16例CR、PR和SD最佳反应患者的治疗时间。图中展示了首次应答时间和数据截止时的状态。

d，瀑布图显示了所有20名患者与其健康供体对应的最佳应答，并以颜色编码的方框表示，供体1、2和5分别由浅蓝色、橙色和紫色表示。

表1.参加研究患者的基线特征。  

2.安全性

本研究的主要终点是安全性。8例患者(40%)出现了1-2级FMT相关毒性反应，主要累及胃肠道，包括腹泻、胃肠胀气和腹部不适，但在第一次抗PD-1治疗前未发生3级或更高的不良事件(表2)。未观察到任何FMT感染微生物的传播，包括SARS-CoV-2。所有患者均能按计划完成FMT治疗。共有17例(85%)患者经历了任何级别的irAEs，其中大多数(70%)发生在开始抗PD-1治疗后的前3个月内(表2)。5名(25%)患者中报告了3级irAEs，包括关节炎(n=2)、疲劳(n=1)、肺炎(n=1)和肾炎(n=1)。这些患者均停止治疗。未报告4级或5级irAEs。没有患者出现既往未报告的FMT相关毒性或irAE。

表2.治疗类型的不良事件(仅FMT相关以及FMT联合免疫治疗)。  

3.临床疗效

次要终点和探索性临床终点分别为客观缓解率(ORR)和生存率。根据RECIST v.1.1标准，13例患者(65%)记录为客观缓解，其中4例(20%)患者达到CR，9例(45%)患者达到部分缓解(PR)。NR患者被认为是未达到CR或PR的患者，包括2例疾病稳定(SD)持续6个月以上，1例SD少于6个月，4例(20%)疾病进展(PD)为最佳反应。通过为事后分析确定，结合CR/PR与SD≥6个月的临床获益率为75%。每个患者在接受FMT后的应答如图1b所示。最佳应答优于PD患者的治疗时间和应答持续时间，如图1c所示。既往接受辅助抗PD-1治疗后进展的患者显示PR(803-08)(图1c)，未出现irAE。3名颅内转移患者中有2名出现了PR。在临床反应方面没有观察到供体效应：供体1与3R和1NR相关，供体2与6R和3NR相关，供体5与4R和3NR相关(图1d)。中位随访20.7个月后，仍未达到中位无进展生存期，16例患者存活。

4.FMT后的肠道微生物组谱和植入

为了研究作为关键次要终点的FMT后肠道微生物组组成的变化，我们前瞻性地收集了四个不同时间点的粪便样本：基线(S1)，FMT后1周和抗PD-1治疗前(S2)、抗PD-1开始后1个月(S3)和3个月(S1)(图1a)，并进行了16S rRNA基因测序分析。在所有时间点，健康供体微生物组的核心丰度α多样性都明显高于患者(图2a)。在检查患者微生物组多样性的演变时，我们观察到无论临床反应如何，从S1到S2多样性增加，且这种增加在S4持续。Bray-Curtis β多样性分析表明，3个供体的微生物群组成不同，而来自患者的S1样本聚在一起。为了进一步阐明FMT后患者微生物组组成分类变化，并确定供体和患者间菌株的植入，我们对18名患者进行了补充宏基因组学鸟枪法测序，从16名患者及其相应供体中获得了序列时间点样本。与16S rRNA基因测序结果类似，使用宏基因组测序发现，无论临床反应如何，物种丰富度随着时间的推移而增加。   本研究采用几种方法来确定FMT后获得性供体-患者相似度。首先，以S1为基线值的患者和供体之间的Bray-Curtis差异倍数变化显示，FMT后1周(S2) R和NR患者的微生物组组成向其匹配的供体移动(图2b)；然而，NR患者的微生物组组成在1个月(S3)和3个月(S4)时回归到各自的基线。相反，R患者在S3和S4时与供体微生物组的获得性相似性进一步增加(P<0.001和P=0.004)。验证了R患者和匹配供体之间微生物群的相似性随时间推移而逐渐增加，而Jaccard指数显示NR恢复到其基线组成。所有患者的16S rRNA基因测序证实了这些结果。 使用StrainPhIAN4推断患者和供体之间的菌株共享，通过宏基因组学分析探索供体菌株特异性植入，这与最近发表的荟萃分析一致。与FMT前相比，R中S2时期的菌株植入率为0.22，并随着时间的推移稳步增加，在S4达到0.4。相反，尽管在S2时NR的植入率达到0.38，但随着时间的推移，植入率出乎意料地下降了(图2c)。为评估阳性植入率的决定因素，本研究根据患者基线微生物组α多样性和体重指数(BMI)对患者进行了分离。结果发现与基线α多样性高的患者相比，低α多样性患者移植的菌株明显更多，尤其是在S2时，这与获得性相异指数的增加相关。同样，高BMI与供体相似性增加有关，Spearman指数证实较高的BMI与基线α多样性呈负相关。

为进一步探索基线多样性对获得性微生物群相似性和菌株植入的影响，我们纳入了先前发表的两项FMT试验的宏基因组学结果，这些试验用抗PD-1联合FMT治疗难治性黑色素瘤患者。与本研究结果类似，两项试验的宏基因组学数据显示FMT对Bray-Curtis相异指数的影响相同，即R患者的整体微生物群向各自的供体移动，与NR患者不同。当测定匹配供体的特定菌株时，R和NR之间的植入率没有差异。与本研究的结果相反，此前的两项FMT试验均未显示黑色素瘤患者低基线多样性与植入率之间的联系。值得注意的是，在三项FMT试验中，基线多样性与结局之间没有关联。

图2.FMT后整体肠道微生物组分析和植入。

a，对来自19名患者每个时间点(S1-S4)的76个粪便样本进行16S rRNA基因分析，供体1为4个样本(浅蓝色圆圈)，供体2为9个样本(橙色圆圈)，供体5为7个样本(紫色圆圈)。

b，所有宏基因组学结果均来自基线n=12 R患者和n=6 NR患者的61个样本。n=1 R和n=1 NR具有可用的纵向样本。患者与其匹配供体之间的Bray-Curtis差异倍数变化，以评估其随时间变化的相似性。相异性减少代表供体和受体之间微生物组组成更接近。

c，菌株植入率的变异性。

d，LEfSe分析S3(FMT后1个月)时R与NR宏基因组测序的差异丰度。

e，R患者S1与S3之间显著细菌进化的热图。仅显示两个时间点间P<0.05的细菌。

f，S1与S3之间R增加的代表性MetaCyc途径。NS，不显著；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

5.FMT后微生物群组成

由于FMT后的微生物组修饰是关键次要终点，我们探讨了FMT后1个月(S3) R和NR之间细菌物种富集的差异。结果观察到，R患者富集Ruminococcaceae SGB15234和SGB14909、Alistipes communis和Blautia SGB4831，而NR患者中Enterocloster asparagiformis和Catabacter hongkongensis的比例过高(图2d)。与NR相比，基线时R患者仅存在Ruminococcaceae SGB14909。 在FMT后1个月的R患者中，我们观察到Ruminococcus SGB15229和SGB1505、Eubacterium ramuleus、Eubacterium sp. AM28 29和Faecalibacterium SSGB15346显著富集(P<0.05)。相反，观察到Clostridium methylpentosum、Enterocloster aldensis、Erysipelatoclostridium ramosum和Enterocloster clostridioformis减少 (P<0.05)(图2e)。NR患者的微生物组组成变化不太明显。 为了验证FMT后微生物组组成的这种变化，对S1和S3之间患者的16S rRNA基因测序数据集进行了ALDEx2差异丰度计算，并证实与NR相比，R患者分类群的变化数量更多。此外，FMT后R中E. ramuleus、Eubacterium siraeum以及Ruminococcus callidus比例过高，而Enterocloster bolteae减少。为确定这些微生物群组成随时间的变化是否由于供体菌株植入受体，我们确定了R和NR之间的差异植入率，并观察到NR优先移植了Flostridium fessum、Anaerostipes hadrus和Phocaeicola dorei。我们试图从宏基因组学数据中确定R和NR患者之间生物学途径的变化。测量了NR和R中S3/S1的倍数变化率，未观察到NR中生物学途径的任何显著变化，而R中发现了多胺生物合成途径的激活和甘油降解途径的抑制(图2f)。

6.FMT后血浆代谢物变化

为了确定FMT对系统通路的功能影响(次要终点)，我们使用靶向和半靶向超高效液相色谱-质谱(UHPLC-MS)和质子核磁共振波谱(1H-NMR)分析了患者在四个时间点的血浆代谢物。FMT诱导了初级胆汁酸和次级胆汁酸的增加。对S2至S4代谢物轨迹的时间和反应综合测试显示，与S2相比，S3的微生物衍生胆汁酸水平相似，但S4的胆汁酸水平较低，与治疗反应无关。相反，随着时间的推移，与NR相比，R中组氨酸含量维持较高水平，而乳酸和琥珀酸水平较低(图3a)。在微生物群相异性分离时间点(S1和S3)的事后比较表明，S3时R中的组氨酸较高(P<0.001)，但FMT前在R中没有升高，而在S1和S3时，R中的乳酸和琥珀酸盐均较低(P分别为0.02和0.03)(图3a)。最后，与短链脂肪酸丙酸存在显著的时间-反应相互作用，在基线时应答组之间没有差异，但在FMT后较高，在S3时R较低 (P=0.04)(图3a)。

图3.FMT后血浆代谢物分析和免疫修饰。

a，通过质子核磁共振波谱法测定13名R和6名NR患者组氨酸和丙酸水平随时间的变化(左和中)。火山图比较了S3时R和NR中增加的代谢物的事后分析(右)。

b，流式细胞术表示S1基线时n=13 R和n=6 NR中存在的循环免疫细胞的无监督t-SNE图。

c，四个不同单核细胞群Mo1(CD14+、HLA-DR+/−、CD15+、CD11b+、CD33+、CD199+和CD16-)、Mo2(CD14+、HLA-DR+/−、CD15low、CD11b+、CD33-和CD199+)、Mo3(CD14+、HLA-DRlow、CD15low、CD11b+、CD33-和CD199+)和Mo4(CD14+、HLA-DR+、CD15low、CD11b+、CD33+和CD199-)在四个时间点的频率。

d，在S1和S3时，13R和6NR之间CD8+ T细胞的监督t-SNE图。蓝色表示ICOS+群体。从t-SNE获得的CD8+ICOS+T细胞的频率。

e、f，S1、S2和S3之间n=11R和n=5NR患者MAIT细胞门控报告的活化CD38+CD8+MAIT细胞频率。MAIT细胞被鉴定为CD3+MR1-5-OP-RU-loaded tet+群体。

g，ELISA测定n=13R和n=7NR之间血清中上皮完整性标志物可溶性ST2随时间的变化。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

7.FMT后免疫改变

作为次要终点，研究了患者免疫状况的变化。为了分析FMT前黑色素瘤肿瘤的免疫景观，我们使用前面描述的单细胞质谱流式细胞术(CyTOF)进行细胞计数。尽管R肿瘤在基线时总体免疫细胞浸润比例较高，但R和NR患者肿瘤总体差异无统计学意义。我们观察到，应答患者的T细胞浸润增加，抗原刺激过的T细胞(CD8+CD45RO+)与黑色素瘤细胞显著接触富集，与我们之前的研究一致；然而，包括CD8+和CD4+T细胞在内的免疫浸润比例最低的6个黑色素瘤中有3个来自R患者。   使用流式细胞术检测FMT前后外周血单核细胞(PBMC)标志物的变化。无监督t分布随机邻域嵌入(t-SNE)显示，CD4+、CD8+ T细胞和自然杀伤细胞的淋巴细胞群随着时间的推移相对稳定；然而，与结局相关的4个不同的CD14+单核细胞(Mo)亚群的比例在FMT前后保持不变(图3c)。NR患者中Mo 1-3亚群均升高，并与HLA-DR低表达和CD199/CCR9(一种参与将细胞动员到肠道的趋化因子受体)阳性相关(图3c)。我们的分析表明，丰富的Mo 1群体(占NR中所有PBMC的10%)是假定的单核细胞髓源性抑制细胞(M-MDSC)。R患者表现出更高百分比的Mo 4单核细胞亚群(HLA-DR+、CD33+和CD199-)。循环CD8+ T细胞在抗PD-1 R患者中更活跃。本研究证明，仅在R患者中ICOS+CD8+ T细胞群在FMT后显著增加(图3d，e)。此外，我们检查了黏膜相关恒定T细胞(MAIT)，因为它们具有识别和响应微生物的能力。虽然总体MAIT细胞群保持稳定，但我们观察到FMT后R和NR之间的表型变化，S3时R中活化CD38+CD8+ MAIT细胞频率增加，NR中PD-1+ MAIT细胞频率增加(图3f)。 本研究还测定了血清白细胞介素(IL)-1受体样1(IL-1RL1或ST2)，这是肠道通透性的标志物之一，因为癌症和上皮功能障碍相关的慢性回肠病变有关。配对分析显示，尽管R患者基线水平较高，但与NR患者相比，这些患者的可溶性ST2水平显著降低，这可能反映了上皮完整性的改善(图3g)。

8.人-鼠FMT实验

为了证实本试验中观察到的FMT的治疗潜力，我们在avatar、抗生素处理的小鼠模型中进行了几次FMT实验。为了确定健康供体是否具有诱导抗PD-1反应的有益微生物群，我们用来自单个供体的粪便重新定植抗生素处理的小鼠。来自3个供体的FMT恢复了抗PD-1对MCA-205肉瘤肿瘤的疗效。接下来，在不同的时间点S1或S3，用来自3R和1NR的样品重新定植抗生素处理的小鼠。在S1时收集的所有患者的粪便均未诱导对MCA-205肿瘤的抗PD-1反应(图4a)。相反，R S3样本再现了患者的临床结局，而NR S3样本未能诱导抗PD-1反应(图4b)。在第二个小鼠肿瘤模型中，来自3R或1NR的FMT前粪便(S1)并未使肿瘤对抗PD-1敏感，但所有来自R患者的S3粪便能够诱导针对B16-OVA黑色素瘤的抗PD-1反应(图4c)。我们将来自每个FMT和处理条件的小鼠数据作为单个点并进行分析，并证实只有R S3样本在两种肿瘤模型中恢复了抗PD-1反应。   随后，作者表征了来自R患者S1和S3样本的FMT联合抗PD-1后MCA-205肿瘤的肿瘤微环境。当我们比较接受R S3样本FMT的小鼠时，观察到与R S1样本相比，记忆CD8+ T细胞和TIM3+CD8+T细胞上调(图4d)。这一结果在B16模型中得到了证实。接下来，比较了用与抗PD-1反应无关的粪便(R S1+NR S1+NR S3)重新定植的动物(n=74)和用与抗PD-1反应相关的R S3样本合并定植的小鼠(n=45)的16s rRNA基因测序数据。R S3小鼠的α多样性增加，β多样性证明了两组间独特的细菌集群。在分类群水平上，R S3小鼠中Barnesiella、Eubacterium ventriosum和Ruminococcus增加(图4e)。

为了进一步支持健康供体FMT在增强抗PD-1活性方面的潜在作用，我们在无菌小鼠中进行了FMT再定植实验，该实验参照了临床试验设计：(1)来自R或NR患者的基线样本；(2)健康供体；(3) S1时R患者的FMT和抗PD-1治疗前匹配健康供体的第二次FMT，以模拟试验中的患者状况(图4f)。通过该实验设计，本研究独立检查了两名具有匹配和不匹配供体的R患者的基线样本。与抗生素处理小鼠实验类似，基线样本S1在抗PD-1后没有抗肿瘤活性(图4f)。接受供体FMT的小鼠显示出对抗PD-1的显著反应。此外，用与匹配供体进行了第二次FMT的R S1样本重新定植的动物与试验中的患者相似，避免了抗PD-1抗性(图4f)。最后，我们使用来自第三名R患者和匹配供体的S1粪便在抗生素处理小鼠中参照临床试验设计，验证了第二次FMT能够恢复avatar小鼠的抗PD-1反应。

图4.人-小鼠FMT实验。

a，S1时3名不同R患者或S1时1名NR患者(n=5)在接种肿瘤前14天接受FMT，使用IsoPD-1或抗PD-1治疗的n=20只携带MCA-205肿瘤的抗生素处理小鼠的肿瘤生长大小(左)和处死时大小(中)。

b，在n=20抗生素处理的小鼠中进行类似的实验设置，这些小鼠接受来自S3(左和中)时3名不同R患者(左和中)和S3时1名NR患者(n=10)的FMT。

c，在肿瘤接种前14天接受来自S1(左)和S3(右)的3例不同R患者的FMT后，用同型对照(IsoPD-1)或抗PD-1治疗的B16-OVA肿瘤小鼠在处死时的肿瘤大小。

d，流式细胞术分析在S1或S3时接受两名R患者FMT的n=10只小鼠的MCA-205肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞中记忆性CD8+ T细胞(CD44highCD62L−/low)和TIM3+CD8+T细胞的频率。

e，通过对比来自R S1+NR S1+NR S3的FMT后抗PD-1耐药小鼠粪便样本(n=74)与来自R S3的FMT后抗PD-1敏感小鼠(n=45)粪便样本的16S rRNA基因测序分析，获得了LEfSe细菌差异表现。

f，无菌小鼠实验中三种不同条件的示意图。将各小组关在不同笼子中，然后接受同型对照抗体或抗PD-1治疗。条件1中处死小鼠时肿瘤大小；条件3首先接受R S1的FMT，随后接受匹配供体的补救性FMT。以平均值±s.e.m.表示。*P<0.5，**P<0.01，***P<0.001。每个圆圈代表一只小鼠。  

讨论

该临床试验报告了在一线治疗中，使用健康供体粪便口服胶囊FMT联合单药抗PD-1治疗晚期黑色素瘤患者的安全性。本研究的结果证实了FMT的安全性，FMT通常用于治疗难治性艰难梭菌(Clostridioides difficile)感染。当与抗PD-1联合使用时，85%的患者出现了irAE，25%的患者出现了3级毒性，没有4级或5级事件。在随机III期临床试验中，抗PD-1的任何等级毒性发生率为79.5%-93.2%，而3-5级毒性发生率为13.3%-34.0%。因此，本研究结果表明，在抗PD-1中加用FMT不会增加irAEs的发生率。 本研究的临床疗效数据显示，III期随机试验(42%-45% ORR和54%-63%临床获益率)和实际数据(17.2%-51.6% ORR和39.1%-67.7%临床获益率)报告的结局优于纳武单抗或派姆单抗单药治疗。然，该试验的样本量小且缺乏抗PD-1对照组，限制了疗效数据的解释。 本研究的试验在几个关键领域与先前的两项针对黑色素瘤患者的FMT联合ICI试验不同。除了评估单剂量FMT联合抗PD-1单药治疗在前期治疗中的作用外，我们还使用健康供体粪便来制备FMT胶囊，而不是R患者供体的粪便。鉴于大型试验招募患者供体的局限性，使用健康供体为此类研究提供了一种安全的选择。其次，我们使用标准的基于PEG的肠道准备，没有用广谱抗生素对患者进行预处理。此外，我们只使用口服胶囊进行了单次FMT，而不是通过结肠镜检查或两者组合。最近一项1b期随机临床试验将抗PD-1与一种富含孢子形成细菌和非孢子形成菌(瘤胃球菌)的口服活生物治疗产品联合使用，报告的数据显示晚期黑色素瘤患者的ORR较低。在本研究中，研究组患者接受了口服万古霉素预处理，最终观察到的植入效果并不理想，这突出了充分的肠道准备和微生物组操作以提高ICI疗效的复杂性。 本研究发现，尽管供体的基线微生物群组成存在巨大差异，但供体对结局没有影响，FMT导致所有患者在FMT后和抗PD-1治疗前的受体和供体之间获得相似性。值得注意的是，这种获得的相似性仅在R患者中持续存在。重新分析来自Baruch等人和Davar等人的宏基因组学数据时，我们观察到了类似的结果，其中R微生物群向各自的供体移动；然而，在评估特定的供体菌株植入时，我们发现R和NR的植入范围相似。在确定其他两项FMT试验中的菌株植入时，我们发现即使研究之间的植入率存在差异(Baruch等人的植入率最高，可能因为相对于Davar等人和本研究的试验，该研究采用系列FMTs试验设计)，但这与结局没有相关性。与其他两项试验不同，我们发现基线时与高BMI相关的较低α多样性与植入增加有关。这可能是由于α多样性较低的个体更容易接受肠道微生物组的定植。

未来的FMT试验需要进一步评估植入率的决定因素。总体而言，这些独立的结果表明，成功的FMT在微生物组中产生了更持久的转变。值得注意的是，NR中倾向于植入的细菌包括C. fessum、A. hadrus和P. dorei，这可能会阻止整体微生物生态系统向供体转移；然而本研究无法确定理想的供体微生物组组成，样本量小是本研究的主要局限性。 在分析整体分类群水平时，发现R患者的微生物组组成向Ruminococcus SGB15234和SGB15229、A. communis、E. ramuleus和Faecalibacterium SGB15346富集转变，而E. aldensis和E. clostridioformis下调。值得注意的是，基线时R和NR患者之间这些分类群没有差异。来自几个黑色素瘤队列的宏基因组学测序证实，Ruminococcaceae、Eubacterium和Alistipes与疗效相关，而Clostridium和Enterocloster与ICI耐药性相关。在此前的两项FMT试验中，R患者FMT后Ruminococcus和Faecalibacterium也有所增加。 此外，未观察到明显的供体效应，可能表明健康的供体FMT可以改善整体微生物组健康特征，例如与肠漏综合征相关的癌症相关生态失调。癌症生态失调的特征FMT后R患者肠道中Enterocloster sp.的细菌过表达减少，而FMT后R患者中Eubacterium的细菌低表达增加。R中多胺生物合成途径的转变进一步为FMT后微生物群的有益修饰提供了证据。值得注意的是，包括亚精胺在内的多胺会随着年龄的增长而减少，并且最近被证明可以通过直接激活线粒体功能来促进细胞毒性CD8+ T细胞的激活，从而规避小鼠的抗PD-1耐药性。本研究的结果为进一步分析、确定对癌症患者有益FMT的微生物组替代标志物提供了依据。 设计该试验并非为了确定哪些患者在没有FMT的情况下对抗PD-1治疗有反应。CyTOF肿瘤内分析发现，基线时，4名R患者的肿瘤内免疫细胞浸润比例高于NR，这与基线肿瘤微环境特征与ICI反应改善之间的关联一致；然而，需要注意的是这种差异在这个队列中没有统计学意义，很可能是由于样本量过小。这个分析队列中来自R患者的3个肿瘤的免疫细胞浸润比例最低，这表明不仅仅是具有早先存在高免疫浸润黑色素瘤的患者对FMT和抗PD-1联合治疗有反应。 同样，免疫监测显示，在FMT前，R和NR患者全身免疫特征相似；然而，在联合治疗后R患者外周血中活化的ICOS+CD8+ T细胞增加。还观察到，在R患者首次抗PD-1后，R患者活化的CD8+ MAIT细胞水平更高。ICOS+CD8+T细胞和MAIT细胞的上调与ICI后小鼠模型和黑色素瘤患者临床结局的改善有关。我们还观察到NR患者中高水平的抑制性M-MDSC群。外周血中高水平的M-MDSC与黑色素瘤患者对ICI和FMT的原发性耐药性有关；但鉴于该试验的单臂性质，需要前瞻性随机研究来确定FMT和FMT后患者移植的替代免疫标志物的免疫调节作用。同时，对血浆代谢物等微生物组活性标志物进行了评估。尽管没有验证队列，但我们观察到FMT后R患者的血浆氨基酸组氨酸增加并保持较高水平。组氨酸与非小细胞肺癌CD8+ T细胞活化增加和ICI反应改善有关。此外，FMT后血浆胆汁酸增加，并在初始剂量抗PD-1后仍保持较高水平。尽管这些胆汁酸与两种情况下的成功结局无关，但值得注意的是它们主要以次级胆汁酸为主。在难治性艰难梭菌感染背景下，FMT疗效的一个关键机制是胆汁代谢酶的恢复以及肠道内初级胆汁酸向次级胆汁酸的相关转化。这些观察结果受到研究中患者数量少的限制，应在FMT试验和机制性临床前研究中进行验证，以进一步了解FMT在改变受试者代谢组学谱中的作用。 尽管用人类粪便样本重新定植小鼠微生物组存在局限性，但我们使用小鼠avatar模型进行了几项实验。这些实验表明，基线R患者微生物群组成抑制抗PD-1活性。来自供体的FMT或FMT后R患者通过增加肿瘤微环境中记忆CD8+ T细胞的浸润来恢复抗PD-1的功效。

R患者首次抗PD-1治疗后接受FMT的小鼠具有更高的多样性和独特的微生物群组成，Ruminococcus spp.和Eubacteriumspp.富集。这些实验在小鼠模型中重现了临床试验设计，为健康供体FMT在调节抗肿瘤免疫反应和抗PD-1活性中的作用提供了进一步的机制见解。 本研究提供的证据证明了来自健康志愿者的微生物组调节疗法在黑色素瘤患者一线环境中的安全性；然而，关键问题仍然存在，例如确定受体和供体之间的最佳细菌相容性、最合适的供体、FMT的时间和途径以及是否需要多次FMT。值得注意的是，在ICI开始前对患者的生态失调微生物组进行表征可能有助于合理确定哪些患者应该在ICI治疗前接受FMT。本研究的结果表明，来自健康供体的FMT可作为一种安全的新型治疗工具，应在随机试验中进一步探索其临床潜力。