科研丨温医大＆温医大附一院: ARDS患者的胃肠道微生物组诱导小鼠神经炎症和认知障碍(国人佳作)

编译：微科盟煎蛋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种呼吸衰竭综合症，可引起许多并发症，影响患者的生活质量。ARDS患者的行为和认知障碍已引起越来越多的关注，但其潜在的机制仍然难以捉摸。本研究将社区获得性肺炎(CAP)所致ARDS患者的粪便微生物群转移到接受抗生素处理的雄性小鼠体内，以探索微生物群-肠-脑机制。通过旷场试验、Morris水迷宫和Y迷宫试验评估小鼠的行为功能。采用16S rRNA测序分析肠道菌群的结构和组成。免疫荧光染色观察小鼠大脑皮层和海马的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。结果表明，ARDS/CAP患者肠道菌群的主要特征是革兰氏阴性菌的丰度高于正常对照组。

ARDS/CAP患者的肠道微生物群促进了小鼠的神经炎症和行为功能障碍。接受ARDS/CAP患者粪便移植的小鼠循环脂多糖(LPS)增加、全身炎症和结肠屏障通透性增加。这可能会对血液屏障通透性产生不利影响，并促进小胶质细胞活化、星形胶质细胞增殖和神经元丢失。本研究提出了微生物群-肠-脑相互作用在ARDS/CAP相关行为障碍中的作用，并提示肠道微生物群在临床实践中可作为保护ARDS患者脑健康的潜在靶点。    

论文ID

原名：Gastrointestinal microbiome of ARDS patients induces neuroinflammation and cognitive impairment in mice

译名：ARDS患者的胃肠道微生物组诱导小鼠神经炎症和认知障碍

期刊：Journal of Neuroinflammation

IF：9.3

发表时间：2023.7

通讯作者：高红昌，李玉苹

通讯作者单位：温州医科大学药学院；温州医科大学附属第一医院

DOI号：10.1186/s12974-023-02825-7

实验设计

结果

1 ARDS/CAP患者肠道微生物群组成发生变化

本研究共纳入21例ARDS/CAP患者和21例健康对照者(CTRL)。ARDS/CAP组和CTRL组之间在性别和年龄上没有显著差异(表S1)。值得注意的是，ARDS/CAP患者的降钙素原、C反应蛋白和IL-6水平急剧升高，远高于正常范围(表S1)，表明有高度炎症反应。然而，ARDS/CAP患者的IL-2、IL-4和TNF-α水平仍在正常范围内(表S1)。然后采用16S rRNA测序分析ARDS/CAP患者粪便样本的肠道微生物群特征。结果显示，ARDS/CAP患者的chao1指数(图1a)和观察到的物种数(图1b)明显高于CTRL受试者，但Shannon(图1c)和Simpson(图1d)指数较低。这些结果表明，ARDS/CAP患者的物种总数增加，但物种多样性下降。图1e显示ARDS/CAP患者门水平的肠道微生物群的相对丰度发生了改变。ARDS/CAP患者中(拟杆菌门+变形菌门)/厚壁菌门(B+F)/F比值高于CTRL受试者(P=0.06，图1f)，表明ARDS/CAP患者革兰氏阴性细菌较为丰富。基于属水平肠道微生物群的PCoA分析，ARDS/CAP组和CTRL组之间的明显分离表明ARDS/CAP患者相对于CTRL受试者表现出不同的微生物模式(图1g)。随后，采用火山图分析来鉴定ARDS/CAP组和CTRL组之间发生显著变化的关键肠道微生物(图1h)，并以热图的形式呈现(图1i)。共鉴定出144种肠道微生物，其中ARDS/CAP患者中有111种(77.08%)肠道微生物与CTRL受试者相比显著增加(附加文件1：表S2)。本研究还发现39种革兰氏阴性菌在ARDS/CAP患者中富集，其中变形菌门29种(93.55%)，拟杆菌门10种(83.33%)(附加文件1：表S2)。总体而言，本研究结果显示ARDS/CAP患者的肠道微生物群发生了显著变化，特别是革兰氏阴性菌的丰度增加。

图1. ARDS/CAP患者肠道微生物群特征。a，chao1指数。b，观察到的物种数。c，Shannon指数。d，Simpson指数。e，门水平肠道微生物群的相对丰度。f，(拟杆菌门+变形菌门)/厚壁菌门的比值。g，基于属水平肠道微生物群的PCoA。h，火山图分析确定ARDS/CAP患者与正常对照(CTRL)受试者之间显著改变的关键肠道微生物。i，热图显示ARDS/CAP患者和CTRL受试者之间的关键肠道微生物。两组之间各项指标的统计差异通过双尾非配对T检验进行评估，当P< 0.05时显著。显著水平：*P< 0.05；***P < 0.001。

2 ARDS/CAP患者微生物群移植至抗生素处理的受体小鼠

为了研究ARDS-CAP微生物群对大脑健康的影响，将ARDS-CAP患者或CTRL受试者的粪便微生物群转移到接受抗生素处理的雄性小鼠中，每天一次，持续4周，在本研究中分别命名为ARDS-R和CTRL-R(图2a)。相对于CTRL-R小鼠，ARDS-R小鼠在门水平上的肠道微生物群相对丰度发生了变化(图2f)，其中(B + F)/F比值在ARDS-R小鼠中明显升高(图2g)，这意味着ARDS-CAP患者中增加的革兰氏阴性菌转移到受体小鼠中。属水平肠道微生物群的PCoA分析显示，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠表现出明显的鉴别性微生物模式，如图2所示。然后，通过火山图分析鉴定了ARDS-R和CTRL-R小鼠之间显著改变的肠道微生物(图2i)。结果显示，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠中Eubacterium、Barnesiella、Escherichia-Shigella和Lactobacillus丰度显著更高，而Muribaculum、 Ruminococcacee_NK4A214_group和Blautia的丰度较低(图2j)。其中，ARDS/CAP患者中丰度较高的Eubacterium、Barnesiella、Escherichia-Shigella和Lactobacillus被转移到受体小鼠。

图2. 肠道微生物群从ARDS/CAP患者转移到受体小鼠。a，FMT实验流程图：适应1周后，用抗生素(Abx)混合物处理小鼠7天。然后，将来自ARDS-CAP患者或正常对照(CTRL)受试者的粪便微生物转移到经Abx处理的受体小鼠(ARDS-R和CTRL-R)体内4周。b，ARDS-R和CTRL-R小鼠在门水平上肠道微生物群相对丰度的变化。c，ARDS-R和CTRL-R小鼠(拟杆菌门 + 变形菌门)/厚壁菌门比值的变化。d，基于属水平肠道微生物群的PCoA。e，火山图分析确定ARDS-R和CTRL-R小鼠之间显著改变的关键肠道微生物。f，ARDS-R和CTRL-R小鼠之间关键肠道微生物相对丰度的变化。两组之间各项指标的统计差异通过双尾非配对T检验进行评估，当P< 0.05时显著。显著水平：*P< 0.05。

3 ARDS/CAP微生物群导致结肠屏障损伤和全身炎症

为了研究ARDS/CAP微生物群对肠道的影响，本研究分析了小鼠结肠的形态学、炎症和紧密连接蛋白。结果发现，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的隐窝长度(图3a和b)和杯状细胞数量(图3a和c)显著减少，表明接受ARDS-CAP微生物群的小鼠肠道稳态受到破坏。相对于CTRL-R小鼠，ARDS-R小鼠结肠中ZO-1(图3h)和occludin(图3i)的mRNA表达水平明显降低。此外，免疫荧光分析证实，在蛋白水平上，ARDS-R小鼠ZO-1(图3d和e)和occludin(图3f和g)相比于CTRL-R小鼠显著降低。这些结果表明，接受ARDS/CAP微生物群的小鼠结肠屏障完整性受损。此外，ARDS/CAP微生物群也可能促进小鼠的结肠炎症反应，如IL-6、TNF-α和IL-1β水平显著升高(图3j–l)。

与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的血清脂多糖(LPS)显著增加，这可能是由于肠道屏障通透性增加(附加文件1：图S1a)。这一发现与ARDS/CAP患者的临床结果一致，如肠道通透性指标水平显著升高，包括DAO(二胺氧化酶，P  = 0.001)和LPS(P = 0.015)(表S1)。LPS已被公认为来源于肠道微生物群的关键促炎产物，分别通过HE染色和F4/80免疫染色观察到ARDS-R小鼠肺部的炎症浸润和M1巨噬细胞活化(图S1b)。此外，我们还检测到，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠肺部的IL-6(图S1c)和TNF-α(图S1d)水平显著更高。ELISA检测结果显示，ARDS-R小鼠血清中的IL-6(图S1e)和TNF-α(图S1f)水平明显高于CTRL-R小鼠。综上所述，本研究结果表明，ARDS/CAP患者的肠道微生物群可能通过破坏结肠屏障完整性和增加内毒素流入来促进炎症反应。

图3. ARDS/CAP患者的肠道微生物群可引起小鼠结肠屏障损伤和炎症。a，苏木精/伊红(HE)染色显示接受ARDS/CAP患者(ARDS-R)或正常对照受试者(CTRL-R)粪便微生物群的小鼠的结肠结构变化；图像比例：200 ×。b，结肠隐窝长度。c，结肠杯状细胞的数量。d、e，ARDS-R和CTRL-R小鼠结肠中(d) ZO-1和(e) Occludin的mRNA表达水平。f、h，结肠ZO-1的免疫荧光检测及定量结果；图像比例：200 ×。g、i，结肠Occludin的免疫荧光检测及定量结果；图像比例：200 × 。j-l，ARDS-R和CTRL-R小鼠结肠中(j) IL-6、(k) TNF-α和(l) IL-1β的mRNA表达水平。两组之间各项指标的统计差异通过双尾非配对T检验进行评估，当P< 0.05时显著。显著水平：*P< 0.05；**P < 0.01。

4 ARDS/CAP微生物群促进小鼠小胶质细胞活化、神经炎症和神经元丢失

本研究发现相对于CTRL-R小鼠，ARDS-R小鼠皮层中ZO-1(图4a)和occludin(图4a)的mRNA表达水平显著降低。在海马中，ARDS-R小鼠的ZO-1水平低于CTRL-R小鼠(图4c)，而两组之间的occludin水平没有显著差异(图4d)。这些结果表明，ARDS-CAP微生物群可能破坏血脑屏障的完整性。然后，我们使用Iba-1染色来检测ARDS-R小鼠皮层和海马中活化小胶质细胞的密度，代表性的Iba-1染色如图4e所示。定量结果显示，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠皮层(图4f)和海马C1(图4g)、C3(图4h)和DG(图4i)区中Iba-1阳性细胞的数量显著增加。此外，活化的小胶质细胞释放的促炎细胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α)的mRNA表达水平在ARDS-R小鼠的皮层(图4j–l)和海马(图4m–o)中也显著高于CTRL-R小鼠。通过GFAP和NeuN免疫荧光染色检测皮层和海马区星形胶质细胞和神经元的数量，代表性图像分别见附加文件1图S2a和S2f。相应的定量结果显示，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的皮层(图S2b)和海马(包括C1(图S2c)、C3(图S2d)和DG(图S2e))区的GFAP阳性细胞数量显著增加。然而，ARDS-R小鼠皮层(图S2g)和海马C1(图S2h)、C3(图S2i)和DG(图S2j)区的NeuN阳性细胞数量明显少于CTRL-R小鼠。总体而言，ARDS/CAP微生物群可能导致小鼠小胶质细胞活化和星形胶质细胞增殖，导致神经炎症和神经元丢失。  

图4. ARDS/CAP患者的肠道微生物群促进小鼠大脑中小胶质细胞活化和神经炎症。a、b，接受ARDS-CAP患者(ARDS-R)或正常对照受试者(CTRL-R)粪便微生物群的小鼠皮层中(a) ZO-1和(b) occludin的mRNA表达水平。c、d，ARDS-R和CTRL-R小鼠海马中(c) ZO-1和(d) occludin的mRNA表达水平。e，典型的Iba-1免疫染色显示皮层和不同海马区(包括C1、C3和DG)中活化的小胶质细胞的密度；图像比例：200 × 。f–i，皮层(f)和海马(g)C1、(h)C3和(i)DG区中Iba-1阳性细胞的相应定量结果。j–l，ARDS-R和CTRL-R小鼠皮层中(j) IL-6、(k) TNF-α和(l) IL-1β的mRNA表达水平。m–o，ARDS-R和CTRL-R小鼠海马中(m) IL-6、(n) TNF-α和(o) IL-1β的mRNA表达水平。两组之间各项指标的统计差异通过双尾非配对T检验进行评估，当P< 0.05时显著。显著水平：*P< 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。 

5 ARDS/CAP患者的肠道微生物群诱导小鼠行为障碍

为了评估ARDS/CAP微生物群对小鼠行为功能的影响，本研究进行了旷场试验(OFT)、Morris水迷宫(MWM)和Y迷宫试验(YMT)。图5a显示了CTRL-R和ARDS-R小鼠在OFT期间的典型运动轨迹，我们可以看到ARDS-R小鼠在中心区域的距离(图5b，P< 0.05)和时间(图5c，P = 0.053)百分比以及总距离较低(图5d，P = 0.054)。因此，OFT结果显示ARDS-R小鼠出现了焦虑样行为。MWM结果显示，ARDS-R小鼠在训练时的逃避潜伏期明显长于CTRL-R小鼠(图5e)，表明ARDS-R小鼠的学习能力受损。随后，在训练后第5天移除逃生平台以测试记忆能力，CTRL-R和ARDS-R小鼠的典型游泳轨迹如图5f所示。我们发现ARDS-R小鼠的记忆能力受损，其特征是平台频率(图5g)、目标区域距离(图5h)和时间(图5i)百分比相对于CTRL-R小鼠显著降低。此外，与CTRL-R小鼠相比，ARDS-R小鼠的YMT自发交替明显减少(图5j)，而总交替无显著变化(图5k)。这一发现表明ARDS-R小鼠的空间工作记忆和参考记忆受损。因此，本研究结果表明，ARDS/CAP微生物群可导致小鼠的行为障碍。

图5. ARDS/CAP患者的肠道微生物群诱导小鼠行为障碍。a，在旷场试验(OFT)中，接受来自ARDS/CAP患者(ARDS-R)或正常对照受试者(CTRL-R)粪便微生物群的小鼠的典型运动轨迹。b–d，在中心区域的(b)距离和(c)时间百分比以及(d)总距离。e，在Morris水迷宫(MWM)训练期间ARDS-R和CTRL-R小鼠的逃避潜伏期。f，在MWM测试期间，CTRL-R和ARDS-R小鼠的典型游泳轨迹。g-i，在MWM测试期间，CTRL-R和ARDS-R小鼠的平台频率(g)、目标区域距离(h)和时间(i)百分比。j、k，Y迷宫试验中CTRL-R和ARDS-R小鼠的自发交替(j)和总交替。通过ANOVA分析两组之间逃避潜伏期变化的统计学差异。两组之间各项指标的统计差异通过双尾非配对T检验进行评估，当P< 0.05时显著。显著水平：*P< 0.05；**P < 0.01。

6 行为障碍与肠道菌群、屏障功能和炎症有关

为了进一步探讨肠道微生物群、宿主炎症和行为指标之间的关系，本研究进行了相关网络分析。图6a中显示|R|> 0.30和P < 0.05的相关关系，可以看到复杂的微生物群-肠-脑相互作用。本研究的结果表明，小鼠的行为变化与肠道微生物群、结肠屏障功能和宿主炎症密切相关。例如，MWM中目标区域距离百分比(DG)与皮层ZO-1和occludin水平呈正相关，但与皮层IL-1β和肠道微生物(Escherichia-Shigella和Lactobacillus)呈负相关(图6a)。ARDS-R小鼠MWM中目标区域时间百分比(TG)的减少归因于皮层occludin和Blautia的减少以及结肠IL-6和Escherichia-Shigella的增加。海马TNF-α与MWM中的平台频率(PF)和YMT中的自发交替(SA)呈负相关(图6a)。OFT中在中心区域的距离百分比(DC)与皮层occludin呈正相关，但与海马IL-6和结肠ZO-1呈负相关。此外，本研究发现OFT中的总距离(TD)与皮层TNF-α呈负相关，与皮层occludin和海马ZO-1呈正相关，如图6a所示。  

图6. ARDS/CAP患者的微生物群-肠-脑相互作用。a，肠道微生物群、宿主炎症和行为指标之间的相关性网络(|R|> 0.30和P < 0.05)。b，ARDS/CAP患者肠道微生物群对小鼠行为功能不利影响的潜在肠-脑机制。  

讨论

本研究揭示了ARDS/CAP患者的肠道微生物群可能导致小鼠的神经炎症和行为障碍(图6b)。ARDS/AP患者的肠道菌群紊乱，其特征是革兰氏阴性菌更丰富，导致LPS产生增加。ARDS/CAP微生物群通过破坏小鼠结肠屏障完整性来增加LPS进入循环，并导致全身炎症。此外，血脑屏障(BBB)也被破坏，导致小鼠多种脑细胞紊乱，包括小胶质细胞活化、星形胶质细胞增殖和神经元丢失，最终导致行为功能受损(图6b)。 肠漏一直被认为是肠道和肠外疾病的重要致病因素，因为受损的肠道屏障无法防止有害的管腔内容物进入循环，如病原体和微生物毒素。肠漏可能与多种因素有关，包括身体压力、炎症性疾病、饮食因素和致病性感染。本研究发现，ARDS/CAP患者也可能表现出肠漏症状，表现为两种肠道通透性指标DAO和LPS的循环水平显著升高。事实上，肠漏已被发现是败血症或COVID-19所致ARDS患者的主要病理特征。有趣的是，我们发现ARDS/CAP患者的FMT可以诱导受体小鼠结肠通透性增加，这表明肠道微生物组和通透性之间存在联系。值得注意的是，肠道菌群失调和肠漏已被证明可促进许多疾病的进展和严重程度，如COVID-19、肾脏疾病、急性冠状动脉综合征、肝纤维化和代谢性疾病。除了肠漏外，接受ARDS/CAP患者肠道微生物群的小鼠也会出现血脑屏障(BBB)破坏，称为“脑漏”，这表明皮层和海马中紧密连接蛋白的表达水平较低。这可能是因为肠道屏障的渗漏会增加系统炎症反应，从而导致大脑渗漏和神经功能障碍。肠漏和脑漏与阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症等脑部疾病有关。这些因素也可能是造成ARDS/CAP患者行为障碍的原因。因此，作者认为，通过某种方式对肠道微生物进行修饰以增强肠道屏障对于理解ARDS患者神经炎症和认知功能障碍的发病机制具有重要意义。 本研究的另一个发现是，ARDS/CAP患者和接受其肠道微生物群的小鼠革兰氏阴性菌(LPS的主要来源)均显著增加。据报道，LPS作为一种经典的促炎因子可诱导全身炎症，并加重包括神经退行性变在内的疾病进展。一旦发生肠漏，LPS就会涌入血液，然后引起全身炎症。在本研究中，在接受ARDS/CAP微生物群的小鼠中观察到了这种不良现象，包括循环LPS和炎性细胞因子水平升高、结肠炎症以及肺部炎症和巨噬细胞活化。这些结果表明，肠道微生物群失调在ARDS/CAP患者的全身炎症反应中起着重要作用。此外，值得注意的是，LPS可导致脑漏，这可能是接受ARDS/CAP微生物群的小鼠大脑中小胶质细胞活化和星形胶质细胞增殖的原因。异常星形胶质细胞和小胶质细胞进一步促进神经炎症和神经元丢失，导致ARDS/CAP患者出现行为障碍。因此，本研究表明，微生物群衍生的LPS在微生物群-肠-脑通讯中发挥重要的信号分子作用，影响ARDS/CAP患者的行为功能。

结论

本研究提供的证据表明，ARDS/CAP患者的肠道微生物群可以通过肠-脑轴诱导小鼠神经炎症和行为障碍。一方面，革兰氏阴性菌的富集产生了更多的LPS，从而促进炎症反应。另一方面，肠漏和脑漏会加速LPS流入循环，导致全身炎症、大脑紊乱，最终导致行为功能障碍。因此，在临床实践中，建议同时针对肠道微生物群和肠漏可能是预防和治疗ARDS/CAP相关行为障碍的一种有前景的策略。

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