快报 | 单细胞转录组测序揭示了结核性胸膜炎独特的免疫景观

The rains of 2023

作者：杨新婷，晏君，薛玉，孙晴，张芸，郭茹，王潮虹，李雪莲，梁清涛，吴航宇，王冲，廖鑫磊，龙嗣博，郑迈克，魏荣荣，张浩然，刘毅，车南颖，Laurence Don Wai Luu，王桂荣，王毅

第一作者及单位：杨新婷，首都医科大学附属北京胸科医院结核科

通信作者及单位：王桂荣，首都医科大学附属北京胸科医院检验科/北京市结核病胸部肿瘤研究所；王毅，首都儿科研究所实验中心

Single-cell profiling reveals distinct immune response landscapes in tuberculous pleural effusion and non-TPE

Front Immunol, 2023, 14:1191357. 

doi:10.3389/fimmu.2023.1191357.

PMID：37435066.

研究背景

结核性胸膜炎是最常见的肺外结核之一，也是胸腔积液的主要病因。结核性胸膜炎有大量的免疫细胞进入胸膜腔，为研究感染部位的免疫应答与保护性免疫反应提供了一个很好的模型。单细胞测序（scRNA-seq）是分析免疫反应和各种细胞群的有力工具，本研究通过对结核性胸腔积液（TPE）、漏出性胸腔积液（TSPE）和恶性胸腔积液（MPE）中单个核细胞进行单细胞转录组测序，提供了结核性胸膜炎独有的免疫景观，以及TPE、TSPE和MPE之间不同的免疫应答特征，有助于全面了解TPE患者的保护性和致病性的免疫应答。

研究方法

采用前瞻性研究方法，纳入首都医科大学附属北京胸科医院有完整医疗记录、抗结核治疗时间＜3 d且至少能够采集到50 ml胸腔积液的10例患者，根据Light标准将其分为漏出性和渗出性。所有患者的胸腔积液首先采用标准的密度梯度离心分离单个核细胞并检查细胞活力，确保每份样本的细胞活力>90%，对每份样品进行包封生成5 '基因表达谱。使用商业乳化微流控平台扩增cDNA并用于制备单细胞RNA-seq文库。将原始数据进行下一步的量化、注释、免疫细胞亚型的状态评分与统计分析。

结核性胸膜炎患者的纳入标准为：

（1）胸腔积液结核分枝杆菌培养、GeneXpert MTB/RIF或PCR阳性；

（2）医生根据临床表现、胸腔镜和影像学资料诊断为活动性结核性胸膜炎。

排除标准为：

（1）合并恶性肿瘤；

（2）正在接受免疫抑制治疗；

（3）妊娠。

研究结果

一、胸腔积液中单细胞转录谱特征

10例患者中，6例为TPE（TB，n=6）、2例为TSPE（CO，n=2）、2例为MPE（CT，n=2）（图1A）。10例患者共获得了70 034个细胞转录组，平均有5977个独特的分子标识符（UMIs），代表2097个基因（图1B）。在降维聚类图（UMAP）上鉴定了9种主要的细胞类型和37个亚型（图1C、1D）；在免疫细胞的数量上，相较于漏出液，TPE中NK细胞显著减少，而CD4+ T、B和PB细胞相对增多；相反，与TPE相比，MPE中DCs、Mono和Macro细胞的比例明显增加，而CD4、B、PB和CD8细胞的比例均降低（图1E）。疾病严重程度的方差分析q值的热图见图1F。这些数据表明，TPE患者在主要免疫细胞水平（如NK、Mono、Macro）与非TPE患者不同，可能作为一种很有前景的生物标志物去诊断TPE与非TPE患者。

注

A：研究设计示意图，共10例患者，其中漏出液（TSPE）2例、恶性胸腔积液（MPE）2例、结核性胸膜炎（TPE）6例。

B：条形图显示了每份样本的log10转换细胞数，红色为6例TPE，绿色为2例MPE，灰色为2例TSPE。

C：10例患者的37个细胞亚型的聚类结果。每个点代表一个细胞，根据细胞类型着色。

D：3组患者37种细胞亚型的UMAP图。

E：通过RO/E估计的3组患者中主要细胞簇的丰度。

F：疾病严重程度的方差分析q值的热图

图1  研究设计示意图和单细胞转录组分析总图

二、TPE患者中Th1和Th17反应激活以及T细胞的凋亡

T细胞具有高度的多样性，共计19种T细胞亚型被描述，包括9种CD4+ T细胞亚型、9种CD8+ T细胞亚型、1种MAIT细胞亚型。

在TPE患者中，CD4+ T细胞表达丰富的Th1基因标识（TBX21, GNLY, BHLHE40, IFNG）（图2A），与Th1细胞IFN-γ表达量显著高于TSPE和MPE患者（图2B）；此外，TPE患者中1个CD8+ T细胞亚型（CD8_Pro）IFN-γ的表达量也显著升高（图2B），提示CD8_Pro T细胞可能是TPE患者中IFN-γ的另一个来源。同时，CD4+ T细胞还表达丰富的Th17基因标识（CCR6，RORA，RORC，IRF4，STAT3和IL23R），提示Th17反应被激活（图2A）。以上结果表明，TPE患者中CD4+ T细胞主要以Th1和Th17反应为主。在细胞毒性方面，TPE患者效应T细胞毒性评分最低，而TSPE患者效应CD8+ T细胞亚群的细胞毒性评分最高（图2C）；与TSPE和MPE相比，TPE中激活的T细胞并没有表现出更高的耗竭评分（图2D），也未观察到耗竭T细胞及抑制性分子的高表达，表明TPE患者中CD4+ T和CD8+ T细胞可能未发生耗竭；通过对细胞凋亡相关基因通路XAF1、TNF和FAS的研究显示，TPE患者中XAF1和IRF1的表达均显著增加（图2E），除XAF1介导的凋亡通路外， TPE患者中TNFSF10及其受体TNFRSF10B的表达均上调（图2F），且另一个TNF通路中TNFRSF25的表达量也有所增加。对于FAS通路，TPE患者的T细胞中FAS、FASLG、FADD、TRADD和CASP8的表达均明显降低（图2F），这些结果支持了TPE患者可能由于XAF1-和TNF-凋亡通路相关基因的上调而导致T细胞凋亡增加的假说；而TPE患者的T细胞并没有表现出更强的迁移评分（图2G）。

注

A：Th1和Th17标识的基因表达UMAP图。

B：CD4_Th1-01、CD4_Th1-02和CD8_Pro中IFN-γ表达情况。

C：效应T细胞的细胞毒性评分。

D：活化T细胞的衰竭反应评分和衰竭评分的UMAP图。

E：T细胞中XAF1介导的凋亡通路中XAF1和IRF1的表达。

F：T细胞部分凋亡通路相关基因的表达。

G：细胞迁移评分。B、C、E、G均采用t检验。*：P<0.05, ****：P<0.0001

图2 三组患者CD4+和CD8+T细胞基因表达差异情况

三、TPE患者中NK细胞的耗竭

6类NK细胞亚型被描述，包括未成熟NK细胞（iNK）、幼稚NK（NK_naïve）、NK_CD56、NK_CD160、 NK_Memory（NK_Memory-CD56）和NK_pro（图1D）。活化的NK细胞反应是TPE患者的一个明显特征，有3种NK细胞亚型（iNK、NK_naïve和NK_Pro）显示增多趋势，而NK_CD56、NK_CD160和NK_Memory-CD56呈现下降趋势；此外，TPE患者NK细胞高表达组织驻留分子标识（rNK）且低表达循环相关的分子标识（cNK）（图3A)；在应用PAGA图描述NK细胞状态间的转变和相互关系时显示NK细胞亚簇之间高度相关，NK_Pro可能为一种中间状态，将Ink和NK_naïve与所有其他亚簇（NK_Memory-CD56、NK_CD56和NK_CD160）连接起来，NK_Memory-CD56和NK_CD56之间以及NK_Memory-CD56和NK_CD160之间亦高度关联（图3B），这提示针对NK_Pro这种中间状态的治疗靶点可能是有价值的。与TSPE相比，TPE中NK细胞表达IFN-γ和TNF显著下调，但相对于MPE则显著上调（图3C）。研究发现，TPE患者中NK_Memory、NK_CD56和NK_CD160细胞耗竭相关基因及耗竭标识的表达均显著增高，同时高表达多种抑制性受体如PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、CTLA4和TIGIT（图3D）；NK细胞的凋亡和迁移显示TPE的NK细胞凋亡通路显著激活，其中4个亚群（NK_Naive、NK_CD160、NK_Memory和NK_Pro）的凋亡评分均高于TSPE和MPE患者（图3E）；在本研究中未发现TPE患者中NK细胞的迁移；此外，我们还观察到TPE患者的NK细胞中编码HLA-II类分子（如HLA-DMB、HLA-DPA1和HLA-DPB1）和HLA-I类分子（HLA-A-c和HLA-G）的基因高表达（图3F、3G），HLA-II类分子的上调对于各种通路（如促进NK细胞和树突状细胞之间的连接）非常重要。

注

A：NK细胞不同亚型中基因的表达情况。

B：NK细胞亚型之间 PAGA分析。

C：NK细胞中IFN-γ、TNF的表达情况及细胞毒性评分。

D：NK_memory、NK_CD56和NK_CD160细胞中耗竭相关基因的表达热图。

E：NK细胞亚型的凋亡评分。

F：NK细胞中HLA-II分子的表达热图。

G：NK细胞中HLA-I分子的表达热图。在A-E中均采用t检验；*：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001, ****：P<0.0001, nsp>0.05

图3  NK细胞基因表达差异

四、TPE患者中髓系细胞簇特征

髓系细胞的转录组分析了4个DC细胞亚群、1个单核细胞亚群和1个巨噬细胞亚群（图4A），结果发现TPE患者pDCs高表达微生物识别受体（如TLR7和TLR9）和干扰素生成相关基因（IRF1, IRF7, IRF8, PACSIN1和DERL3），且TPE患者中pDCs比例明显增加，提示pDCs与抗结核作用相关；相反，TPE患者中mDC的占比显著下降。mDCs是主要的抗原呈递细胞，是先天免疫和适应性免疫之间的重要桥梁，我们的分析表明来自TPE的mDCs较高表达了HLA-DR分子，该分子是抗原呈递所必需的；TPE患者中单核细胞比例显著下降，且通过高表达吞噬相关基因和HLA-II类分子发挥吞噬及抗原提呈作用（图4B）；TPE患者的巨噬细胞亚群（Macro: LYZ, CST3, CD68, CD163）比例增多，吞噬功能、抗原提呈作用和HLA-II类相关基因表达上调（图4C）；TPE患者中巨噬细胞凋亡通路TNF-、Fas-和XAF1-相关的基因表达上调，提示巨噬细胞凋亡增加（图4D)。此外，巨噬细胞的激活可导致各种细胞因子和趋化因子的分泌和产生，与TSPE及MPE患者相比，TPE患者中巨噬细胞编码细胞因子和趋化因子的基因表达上调（图4E），巨噬细胞对IFN-γ的反应显著上调（图4F)，这些结果均表明TPE患者中巨噬细胞发挥很强的抗结核作用。

注

A：6种髓系细胞亚型的UMAP投影。

B：单核细胞的吞噬作用及抗原提呈作用评分。

C：巨噬细胞的吞噬作用、抗原提呈和HLA-II分子评分。

D：巨噬细胞中凋亡相关基因表达图。

E：巨噬细胞细胞因子及趋化因子基因表达热图。

F：UMAP图显示不同疾病条件下巨噬细胞中IFN-γ反应信号图。图B-D中采用t检验。*：P<0.05，**：P<0.01，****：P<0.0001，nsp>0.05

图4  髓系细胞基因表达差异的特征

五、TPE患者中B细胞簇的特征

6种B细胞亚型被描述，包括幼稚B细胞（Naïve_B）、生发中心B细胞（GB_B） 、中间过度记忆B细胞（iMemory_B）、表达IGHA 浆细胞（IGHA_PB）、表达IGHM浆细胞（IGHM_PB）和表达IGHB 浆细胞（IGHG_PB）（图1）。TPE患者浆细胞免疫球蛋白基因（IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、IGHA1、IGHA2、IGHM）表达均高于TSPE和TPE（图5B）；TPE患者的Naive_B、GC_B和iMemory_B高表达活化有关的基因（图5C），提示TPE患者中B细胞/浆细胞被活化；TPE患者B细胞亚群高表达抗原提呈相关基因，抗原呈递能力明显高于TSPE及MPE患者（图5D）；MHC分子，尤其是MHC-II类分子在TPE中表达相对于TSPE和MPE显著上调（图5E），这些提示B细胞可能有助于抗结核保护性免疫；此外，我们还观察到了TPF中细胞凋亡相关基因（FAS、XAF1、TNFSF10等）表达上调，提示TPE中的B细胞可能发生凋亡（图5F）。

注

A：浆细胞中重链比例。

B：浆细胞中Ig特征基因表达的UMAP图。

C：B细胞活化相关基因的表达。

D：B细胞的抗原提呈能力。

E：B细胞中HLA-I和HLA-II分子表达的热图。

F：B细胞中凋亡相关基因表达的热图。图D采用t检验，****：P<0.0001

图5  B细胞基因表达差异的特征

六、TPE患者中巨噬细胞是炎症反应的主要驱动因素

最后，我们探讨TPE患者中细胞因子产生的潜在来源，定义了炎症评分和细胞因子评分，并用这两个评分来评估各种细胞类型对炎症的潜在贡献。结果显示，TPE患者巨噬细胞的炎症评分和细胞因子评分显著升高（图6A、6B），提示巨噬细胞可能是TPE中炎症的主要来源；在TPE患者胸腔积液中，炎症和细胞因子评分占到90%（图6C），明显高于其他细胞（图6D），巨噬细胞的百分比仅达到3%（图1E）；TPE中巨噬细胞高表达多种促炎细胞因子（如CCL2, CCL3, CXCL3, CCL8, IL1B等）（图6E、6F），其中前15个表达量最高的促炎细胞因子占总细胞因子评分的90%（图6D），提示这些细胞因子在驱动TPE炎症中起着关键作用（图6E）。

综上所述，巨噬细胞驱动的炎症反应可能是TPE的一个显著特征；我们推断TPE患者的系统性炎症反应可能是巨噬细胞与其他细胞之间通过分泌多种促炎细胞因子的相互作用和相互关联，我们检测了高炎症细胞类型（巨噬细胞）和非炎症细胞类型之间的配体-受体配对模式（图6G、6H），结果显示TPE中的巨噬细胞与DCs、Mono和MAIT细胞有着较强的相互作用（图6G），且这种相互作用主要依赖于CCR1、CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3和ACKR2（图6G、6H），这些结果阐述了在结核感染部位细胞间相互作用的分子基础。

注

A：巨噬细胞中炎症评分和细胞因子评分。

B：UMAP图，主要的细胞类型（左图）和炎症细胞类型（右图）。

C：巨噬细胞对炎症评分和细胞因子评分贡献百分比。

D：9种主要细胞类型的炎症评分（左图）和细胞因子评分（右图）对比。

E：TPE患者巨噬细胞中分泌量最高的15种促炎细胞因子相对贡献百分比。

F：TPE中9种主要细胞类型中特定促炎细胞因子的表达。

G：TPE患者中巨噬细胞与其他免疫细胞类型相互作用，P值用圆圈的大小表示，如右边的比例尺所示。

H：TPE患者中的巨噬细胞与其他免疫细胞相互作用网络

图6  TPE中的巨噬细胞是炎症因子的主要来源

研究结论

我们揭示了TPE不同于TSPE和MPE的独特的局部免疫景观，有助于提高我们对感染部位免疫机制的理解，并提供潜在的治疗干预靶点。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：杨新婷

编辑：孟莉

审校：范永德

发布时间：2023-08-09

打赏