丙泊酚对血管内皮通透性的作用及机制

周芳芳1 祁爱花2　

1上海市第六人民医院妇产科，上海 201306；2上海市第六人民医院麻醉科，上海 201306

国际麻醉学与复苏杂志,2023,44(07):726-731.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20230317‑00840

基金项目 

上海市第六人民医院医疗集团课题（2020015.0）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型探讨不同浓度的丙泊酚对HUVEC活力、内皮损伤相关蛋白［可溶性血栓调节蛋白（sTM）、内皮细胞特异性分子‑1（ESM‑1）、E‑选择素（CD62E）］、内皮细胞紧密连接蛋白［咬合蛋白（occludin）、闭锁连接蛋白‑1（ZO1）、闭合蛋白（claudin 5）］和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 

1、材料与方法

1.1细胞株、试剂和仪器

HUVEC细胞系，细胞培养液，sTM、ESM‑1、CD62E、occludin、ZO1、claudin 5和VEGF的一抗，二抗辣根过氧化物酶（HRP），丙泊酚，中/长链脂肪乳剂，酶联免疫吸附测定仪。

1.2方 法

1.2.1细胞培养

细胞培养在内皮细胞培养基（ECM）中，ECM培养基包含10％胎牛血清、100×103 U/L青霉素和100 μg链霉素。细胞置于95％空气湿度、5％二氧化碳的37 ℃培养箱中，培养基每3 d更换1次。

1.2.2细胞处理、分组及观察

体外培养传3~5代的HUVEC。细胞分入：A组，细胞正常培养组；B组，100 μmol/L丙泊酚组；C组，1 000 μmol/L丙泊酚组；D组，和1 000 μmol/L丙泊酚同等剂量的中/长链脂肪乳剂组。每组处理细胞24 h。每次实验均设2个复孔，每组重复3次，结束后收集各组细胞用于后续分析。

1.2.3MTT法测定细胞活力

将6×103/ml的HUVEC混悬液接种于96孔板中，按上述分组处理24 h后，加入100 g/L的3‑（4，5‑二甲基噻唑‑2）‑2，5‑二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝）（MTT）在常规培养基中于37 ℃一起温育。4 h后，洗涤细胞，然后加入100 μl二甲基亚砜（DMSO）溶解。待结晶物充分溶解后，测定λ=570 nm的光密度。细胞活力（%）=实验组光密度/空白组光密度×100%。

1.2.4Western blot检测

选择生长状态好、处于对数生长期的HUVEC，用0.25%胰蛋白酶（EDTA）消化成单细胞悬液，并进行细胞计数，调整细胞密度为6×105/ml，接种于6孔培养板，每孔2 ml。细胞贴壁后，分别处理24 h收集细胞。用冷PBS（5 ml）洗涤细胞1次，1 000 r/min条件下离心5 min（离心半径20 cm）后去上清液，添加细胞裂解液，然后4 ℃ 14 000 r/min离心10 min（离心半径20 cm），收集上清，加入SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液4∶1混合，并在沸水浴中煮沸5 min。蛋白质浓度采用Bradford蛋白检测法测定。蛋白质（50 μg）上样并转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h后，加入一抗［sTM、ESM‑1、CD62E、occludin、ZO1、claudin‑5和VEGF（1∶1 000）］，4 ℃孵育过夜；洗涤3次，加入HRP标记的二抗（1∶2 000）37 ℃孵育1 h。洗膜，用ECL发光液试剂盒检测。蛋白条带用Quantity One确定数量。以甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，以目的蛋白条带与内参条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

2、结 果     

2.1丙泊酚对HUVEC,细胞活力的影响

A组、B组、C组、D组光密度值分别为0.147±0.012、1.340±0.035、1.054±0.034、1.329±0.027。与A组比较，C组细胞活力明显降低（P<0.05），B组、D组差异无统计学意义（P>0.05）。A组、B组、D组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2内皮损伤相关蛋白的表达变化

与A组比较，C组sTM的表达明显升高（P<0.05），B组、D组sTM表达差异无统计学意义（P>0.05）。与A组比较，B组、C组、D组ESM‑1、CD62E的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3内皮细胞紧密连接蛋白表达的变化

与A组比较，C组occludin的表达明显降低（P<0.05），B组、D组occludin的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与A组比较，B组、C组、D组claudin‑5和ZO1表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4VEGF的表达变化

与A组比较，B组、C组VEGF的表达明显升高（P<0.05），D组VEGF的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

3、讨 论

本研究发现，低浓度的丙泊酚不会下调HUVEC的活力，表明低浓度的丙泊酚确实未损伤内皮细胞，但是高浓度的丙泊酚明显降低了HUVEC的活力，说明高浓度丙泊酚对HUVEC具有损伤作用。

本研究基于细胞模型进一步探讨了不同浓度丙泊酚对体外培养的HUVEC损伤相关蛋白表达的影响。结果显示，对HUVEC给予低浓度丙泊酚刺激，ESM‑1、sTM和CD62E无明显变化，说明低浓度丙泊酚不会损伤HUVECs；而高浓度的丙泊酚上调了sTM蛋白的表达，对ESM‑1和CD62E蛋白表达无明显影响，表明高浓度丙泊酚具有毒性作用，会通过上调内皮细胞损伤蛋白的表达造成HUVEC的损伤。

另一方面，本研究发现高浓度丙泊酚下调occludin的表达，对claudin‑5和ZO1无明显影响，说明丙泊酚引起血管通透性的增高部分是通过下调occludin而实现的。内皮细胞的紧密连接主要由occludin、ZO1和claudin‑5组成，其中occludin是最具代表性的蛋白，它可以通过调节细胞间的连接来控制细胞的通透性，发挥屏障功能。相关研究结果显示，机体静脉稳态的维持离不开occludin的调控。本研究证实大剂量丙泊酚通过上调HUVEC损伤蛋白的表达，以及下调occludin的表达，从而导致内皮细胞功能紊乱。

本研究结果显示，高浓度丙泊酚上调VEGF的表达，即VEGF参与了丙泊酚诱导内皮细胞通透性的增高。本研究结果表明，给予HUVEC高浓度的丙泊酚会上调VEGF的表达，证明丙泊酚诱导的内皮通透性增高部分是通过上调VEGF的表达进而降低occludin引起的。然而，也有不同的研究结果：动物模型发现，丙泊酚通过减少内皮细胞的糖基化和ATP的产生引起内皮细胞功能障碍和血管通透性增加；在大鼠模型中通过血管内注射丙泊酚产生一氧化氮和阻断蛋白的磷酸化导致血管通透性增加，引起组织水肿。这均说明丙泊酚可以通过多种途径诱导血管内皮通透性的增加，其具体机制仍需进一步研究。

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