纳米抗体偶联药物 I Nb Drug Conjugates

前言

纳米抗体偶联药物（Nb drug conjugates，NDC）开发理念与抗体偶联药物 (Antibody drug conjugates，ADC）类似，即将ADC中的“antibody”换成亲和力较高的“nanobody”。与ADC相比，NDC具有清除速率快、稳定性强和肿瘤渗透能力强的优势。

图1 2000年至2020年期间化疗中纳米抗体相关的出版物数量[1]

Nbs与mAb相比在药物开发的潜在优势

组织穿透率：mAbs较大尺寸和Fc区域的存在可以改善药代动力学特性，但也会影响它们的组织穿透能力。较小体积的Nbs可在体内实现更高的组织渗透率和更强的细胞杀伤力。

抗原识别能力：在所有的互补决定区中，CDR3占抗原识别特异性的60-80%。CDR3环长而延伸，此特性赋予VHH更好的抗原识别特异性和亲和力，可以增强对隐藏的肿瘤抗原表位的识别。

稳定性强：与mAbs相比，Nbs具有显著的高热稳定性，Tm值和可逆的热变性。除此之外，Nbs还能抵御蛋白酶、极端pH和疏水剂的变性影响。

串联成多特异性或多价构型：相比于mAbs，Nbs尺寸小，有利于同多种功能不同的抗体域串联，用于多功能药物的输送，增强亲和力的同时也可避免肾脏的快速清除，并增加药物比率。

综合这些特点，与mAbs或其片段对应物相比，Nbs是开发高度稳定，高特异性的药物偶联载体的理想候选者。

NDC开发考虑的关键因素

为了提高NDCs的效率，可以从几个因素考虑：增强Nbs的特异性/亲和力、偶联药物的选择、位点特异性附着策略、药物的位置以及药物与Nbs的比例，如图2所示。

图2 在开发纳米抗体偶联药物（NDC）时需要考虑的因素[1]

药物类型：用于制备NDCs的偶联药物主要分为DNA损伤剂和微管抑制剂。

Linker：linker分子设计是影响药物动力学/药效学关键因素。为了最大限度地提高 NDC 效率，理想的linker应满足：1.在人体血浆中具有高稳定性。2.在肿瘤特定环境下可自行断裂。3.选用亲水性linker以减少NDCs聚集。

药物与抗体的比例：虽然理论上NDC没有显示出较mAbs的药物负载优势，但是NDC在肿瘤部位的有效积累和稳定性要优于ADC。一项研究报道尽管与Nbs相比mAbs具有更高的药物负载能力，但仅有1.56%的ADC能够有效进入目标部位。然而，Nbs的强大特性（高抗原特异性、稳定性、溶解性和较低的免疫原性）将使其相对于mAbs更能有效的进入靶细胞。

位点特异性的偶联策略：相比于ADC，Nbs与药物的简单化学共轭策略的适用性更为广泛，在低生产成本和长期稳定性上甚至超过ADC。对Nbs通常选择赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸作为化学共轭位点，实现更高的药物与Nb比例。然而，这也可能导致异质性NDC混合物，影响整体效力。近年来，蛋白质化学进展使得使用新工具实现药物与Nbs的均质共轭，包括赖氨酸酰胺偶联、插入半胱氨酸残基、插入非天然氨基酸和酶促共轭等。

NDC进展及案例

表1总结出一些可用于靶向化学药物递送的重要靶点信息，这些靶点都有可能在新的NDC的开发中发挥关键作用。

表1 一些用于选择性化疗药物传递的癌症相关抗原[1]

VHH7-DM1

Fang等人[2]报道了一种对小鼠MHC-II特异的Nb（VHH7），其已经预先制备用于sortase连接具有寡甘氨酸修饰的Maytansine衍生物Mertansine（即抗微管剂）或NIR染料Alexa Fluor 647。这种连接技术被用于开发MHC-II特异的NDC和无创生物成像应用。对于NDC的开发，作者使用了二(马来酰亚胺)乙烷连接剂（BMOE）在DMF中与亲水性肽段和Mertansine（DM1）的游离巯基的顺序硫醇-Michael缩合反应，如图3-i所示。然后进行了VHH7和含有DM1的肽之间的sortase反应，从而形成最终的NDC产物（即VHH-DM1）（图3-i）。作者还证明了使用VHH-DM1靶向高侵袭性淋巴瘤的效率。在植入小鼠淋巴瘤A20细胞的体内模型中，发现VHH-DM1处理的动物与其他无抗癌剂DM1的组相比，肿瘤生长显著减缓，参见图3-ii。此外作者还证明了VHH7 Nbs与NIR染料Alexa Fluor 647形成的偶联的无创生物成像应用，用于检测局部和转移性淋巴瘤。

图3 VHH7-DM1结构和表征的示意图[1]

Pt-NGC

Huang等人[3]开发了一种双表位纳米体-药物共轭物Pt-NGC，用于靶向EGFR癌细胞的传递铂（Pt（IV））前药和MRI对比剂的治疗学模型。NGC通过硫醇-马来酰亚胺点击反应进行前药装载，使用Gd3+离子进行MRI对比剂绑定，如图4-i所示。ICP-MS分析确认了药物与Nb的比例，每个Nb有2.7个Pt原子和2.0个Gd原子。NGC能够特异性地结合EGFR阳性细胞，并且Pt-NGC在体内显示出较高的血液滞留水平，如图4-ii所示。Pt-NGCA（Pt-NGC的变体，在C-末端加入anti-HSA Nb）显示出更长的循环时间和较少的器官生物积累，有助于减少细胞毒性副作用（图4-iii）。该研究为基于Nbs的靶向药物传递和生物成像提供了潜在策略。

图4 Pt-NGC结构和表征的示意图[1]

小结

在临床实践中，治疗性抗体药物虽然靶向性强，但是由于其分子量较大，对于实体瘤的治疗效果有限。小分子的化学药物虽然具备对癌细胞的高度杀伤效力，但选择性较差，常常误伤正常细胞，引起严重的副作用。随着Nbs在诊断和治疗应用中被关注地越来越多，基于Nbs的化疗药物有望于肿瘤治疗中取得更好的疗效。

参考文献：

1. Panikar SS, Banu N, Haramati J, Del Toro-Arreola S, Riera Leal A, Salas P. Nanobodies as efficient drug-carriers: Progress and trends in chemotherapy. J Control Release. 2021 Jun 10;334:389-412. doi: 10.1016/j.jconrel.2021.05.004.

2. S. Steeland, R.E. Vandenbroucke, C. Libert, Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies, Drug Discov. Today 21 (2016) 1076–1113.

3. H. Huang, T. Wu, H. Shi, Y. Wu, H. Yang, K. Zhong, Y. Wang, Y. Liu, Modular design of nanobody–drug conjugates for targeted-delivery of platinum anticancer drugs with an MRI contrast agent, Chem. Commun. 55 (2019) 5175–5178. 

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