【中西合璧】穴位埋线改善血管性痴呆大鼠的学习和记忆的障碍

上海中医药大学附属龙华医院麻醉科

介绍

血管性痴呆(Vascular dementia, VD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)之后发病率第二高的认知障碍，是各种脑血管疾病中由脑功能障碍引起的一种获得性智力障碍综合征，可导致学习和记忆障碍(1)在北美和欧洲，VD病例约占痴呆病例的15 - 20%，而在亚洲和发展中国家，这一比例略高，约为30%(2,3)。VD在亚洲的发病率持续上升，不仅增加了个人的经济负担，也对亚洲国家的医疗保险制度提出了巨大的挑战。VD的发病机制尚未完全阐明。目前已知胆碱代谢失衡、突触损伤、氧化应激损伤、神经系统炎症等引起神经元形态结构改变、神经功能障碍，最终导致VD的发生发展。因此，对VD的研究，特别是对其引起的神经功能和形态学变化的研究是基础和临床研究的重点之一。同时，VD的及时预防和早期干预对节约公共医疗资源具有重要意义。

目前，现代医学对VD的治疗方法主要包括脑康复等脑代谢活化剂、钙拮抗剂等脑神经保护剂和联合康复技术，而中医则会根据患者的具体症状应用一些中药或针灸治疗，达到一定的临床效果。与其他治疗方法相比，穴位埋线具有省时、医疗费用低、操作简单方便、无肝肾毒性、不良反应发生率低、症状轻等独特优点。穴位埋线疗法指的是用无菌镊子将一根3-0的肠线(1 - 1.5 cm)插入9号一次性无菌针针尖，肠线与针尖内缘平行，再用钝针跟随，将无菌针插入消毒后的穴位。获得感觉后，在抽出无菌针时，将针刺入，将肠线留在穴位内(4)。研究表明，在皮肤特定部位埋线(穴位埋线疗法)可以持续产生良性刺激，影响神经递质和局部循环，修复受损的神经环路网络，恢复正常中枢功能，调节免疫。并抑制炎症因子的释放(5-7)。此外，我们的早期工作和其他人已经证明炎症在VD的发展中起着重要作用(8- 11)。Toll样受体4 (Toll- like receptor 4, TLR4)是Toll样受体(Toll- like receptor, TLR)的一种，是先天免疫细胞中表达的一种重要的模式识别受体。大量研究表明，TLR4激活介导的神经炎症在卒中、AD等全身性疾病发病时起着关键作用。由于其发病机制复杂，治疗存在争议，导致在神经炎性疾病的研究中扮演不同的角色(12- 14)。因此，我们通过4支血管闭塞术(4- vo)建立了VD大鼠模型。然后，我们对VD大鼠进行穴位埋线治疗，探讨TLR4/髓样分化因子88 (MyD88)/核因子κ b (NF-κB)信号通路是否参与穴位埋线治疗VD的作用及其机制。

方法

材料

兔抗tlr4抗体(BS- 20594r)、兔抗MyD88抗体(BS- 1047R)和兔抗nf -κ b p65抗体(BS- 0465r)来自北京生物合成生物技术有限公司(北京，中国)。兔抗β -肌动蛋白抗体(AC026)和山羊抗兔IgG (ab6721)分别购自ab克隆公司(中国武汉)和Abcam公司(英国剑桥)。尼莫地平片(190309，运城雅宝药业);超RNA试剂盒(CW0581M1, CWBIO，北京，中国);HiScript II一步qRT-PCR绿色试剂盒(Q221-01, Vazyme，南京，中国);苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1 (p12, Solarbio，北京，中国)。苏木精染料(BA4041)和伊红染料(BA4022，珠海贝索，中国珠海)。硝化纤维素(NC)膜(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。立式电泳池(JY-SCZ4+)、电泳仪(JY200C)(北京骏毅，北京，中国);卧式脱色摇床(TY-80A，江苏科研，中国南京);化学发光凝胶成像仪(5200，天能科技有限公司，太原);全功能微孔板读取仪(MK3, Thermo Waltham, MA, USA);高速低温离心机(H2050R，祥益集团，上海);实时荧光量化器[QuantStudio 1, Applied Biosystems (AB)， Forster City, CA, USA];TRIzol试剂:IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒(PI328, Beyotime，中国);IL- 1 β酶联免疫吸附测定试剂盒(PI303, Beyotime，中国)

动物

本研究经贵州中医药大学伦理委员会批准(No. 20221011)。所有实验过程均按照贵州中医药大学实验动物伦理委员会关于动物的照顾和使用的规定进行。在研究开始前准备了一份没有注册的方案。选用健康、无特定病原体(SPF)雄性SD大鼠93只(10 ~ 12周龄，300 ~ 320 g)，购自长沙天秦生物科技有限公司(长沙，中国)，实验动物生产许可证号:SCXK(翔)2019-0014。饲养条件:22 ~ 26℃，50%湿度，12 h/12 h明暗循环。他们可以免费获得水和食物。

VD大鼠模型建立及分组处理

适应1周后，随机分为5组:假手术组(n=12)、模型组(n=15)、穴位埋线组(Ace;n=15)，非穴位埋线组(n- ace;n=15)，尼莫地平组(Nmp;n = 15)。参照前人研究，采用改良4-VO法制备VD大鼠模型(15)。大鼠采用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉，俯卧固定在手术台上。在第一颈椎枕区水平处纵向切开1-2 cm，露出第一颈椎翼状孔。用电凝针烧灼双侧椎动脉4 ~ 5次后缝合切口。在颈部前部和中部作纵向切口1.0 - 1.5 cm。从气管两侧分离约1cm的双侧颈总动脉，用螺纹备用。次日拆除颈线，用微创动脉夹夹住两侧颈总动脉，15分钟后释放动脉夹，恢复血供。缝合切口，在干净的笼子里喂养大鼠。假手术组麻醉后同样固定，分离颈总动脉，但不灼烧椎动脉，不夹持颈总动脉，仅暴露翼状孔外开口。术后缝合切口。然后，将老鼠放回笼子，在醒来后正常喂食。造模成功的标准为:意识丧失、昏迷、翻正复位反射消失、双眼逐渐苍白、双侧瞳孔扩大、夹持双侧颈总动脉后光反射消失。在实验中，如果不符合上述标准或大鼠出现抽搐和死亡，则认为建模失败。在最初纳入实验的93只大鼠中，2只大鼠因造模死亡，1只大鼠不符合造模标准，90只大鼠被纳入实验。

Ace组:造模成功后第8天，在“百会”(GV20)、“气海”(CV6)、“膻中”(CV17)、“三阴角”(SP6)、“膈腧”(BL17)穴进行埋线治疗。用电推剪在穴位进行脱毛和皮肤准备。取长约1.5 cm的肠线，用7号一次性埋线针(中国镇江高冠医疗器械有限公司)埋入上述穴位。埋针后用消毒后的干棉球压针1分钟。埋地管线每15天更换一次，共更换3次。N-ace组:在穴位埋线组所取穴位下方0.5 mm处进行埋线治疗，每15天1次，共3次。Nmp组:尼莫地平溶液灌胃，剂量为20mg /(kg·d)，每天1次，连续45 d。模型组、假手术组、Ace组、N-ace组同时灌胃0.9%氯化钠溶液，自造模后第8天起给药，连续45 d。

Morris水迷宫对空间学习记忆能力的评价

Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)由一个深35 cm、高50 cm、直径200 cm的圆形水箱组成，分为4个象限。MWM包括5天的定向导航测试和1天的空间探针测试。在定向导航测试中，将平台放置在一个象限的中心，在水下1.5 cm处，将大鼠从3到4个入口点放置在水中，让大鼠探索迷宫并找到平台，时间为90秒。在没有找到平台的情况下，老鼠被引导到平台上，并在那里停留10秒钟。记录寻找逃生平台的时间(逃生潜伏期)重复训练5天。空间探针试验时，拆除水下平台，将大鼠置于R点水中。收集并分析大鼠在90秒内进入平台象限并穿越原平台的次数(16)。

通过HE染色检测海马的病理形态学特征

麻醉大鼠连续腹腔注射0 .9%生理盐水和4%多聚甲醛（PFA）。灌注后，用4% PFA固定。取大鼠脑组织进行石蜡切片。切片用苏木精和伊红（HE）染色液染色，观察海马的病理形态学特征。脱水石蜡包埋后，将大鼠脑组织切片成3 mm，切片干燥脱蜡，蒸馏水冲洗，苏木精染色，1%盐酸醇分离，去离子冲洗，伊红染色。最后，它们依次用80%、95%和100%的乙醇和二甲苯I、二甲苯II进行处理。切片用中性胶密封，倒置显微镜下观察病理变化（BX53 Olympus，东京，日本）。

免疫印迹法

取大鼠海马组织，加入放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解液。然后在生物样品均质器中反复磨碎，放在冰上10分钟，以4℃，12000 r/min离心15分钟。收集上清，将120 μL蛋白上清与30 μL混合5×加载缓冲区。将混合物在沸水中煮沸5分钟。10 μL蛋白样品用8%/11%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）凝胶分离，在73 V恒定电压下电泳130分钟；当溴酚蓝电泳到达凝胶底部时，停止电泳。蛋白质电转移到硝化纤维素（NC）膜上，用5%脱脂牛奶（PBST）磷酸盐缓冲盐水在4℃下封闭过夜。然后，将一抗包括抗tlr4（1：2000）、抗myd88（1：1000）、抗NFκB p65（1：1000）和antiβ-actin（1：100000）在4℃下孵育过夜。用PBST洗涤3次（每次10分钟）后，用二抗（1：5000）在室温下孵育80分钟。最后，使用ChemiDoc XRS（Bio-Rad，USA）扫描加入曝光液的膜，并使用图像实验室软件（Bio-Rad）对图像进行量化。

实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测海马组织TLR4、MyD88和NF-κB信使RNA表达

用TRIzol试剂提取大鼠海马组织的总RNA。互补DNA（cDNA）采用PrimeScript RT试剂试剂盒（RR047A，Takara，志贺，日本），以RNA为模板，获得互补DNA。根据TB Green TM混合物Ex TaqTM II [Tli RNaseH Plus（RR820A，Takara，日本）]指令，检测TLR4、MyD88和NF-κB的信使RAN（mRNA）水平，并归一化为β-actin。引物序列采用Primer 5软件设计，结果见表1。结果采用相对定量法2进行分析-ΔΔCt方法

酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）和IL-1β水平

6只大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠，导致炎症的细胞因子（IL-6、IL1 β和IL10）使用ELISA试剂盒(IL-1β ELISA套件:SEKR-0002，；IL - 6 ELISA套装：SEKR-0005基于制造商的协议。使用酶标仪（Thermo Fisher，USA）检测450 nm处的吸光度。

统计分析

所有值均以均值的平均±标准误差（SEM）表示。数据采用SPSS 20.0软件（IBM公司，Armonk，NY，美国）进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）来比较两组间的差异。P值<为0.05被认为有显著性差异。结果经至少3个独立实验验证。

结果

穴位肠线包埋可减轻VD大鼠的空间学习记忆障碍

为了明确穴位埋线在VD大鼠中的作用，我们采用4-VO手术建立VD大鼠模型。我们首先通过MWM实验中逃避潜伏期、目标象限停留时间和穿越平台次数来考察各组大鼠的空间学习记忆能力。结果显示，在训练2-6 d时，Mod组的逃避潜伏期明显长于Sham组(P<0.01)，而Ace组和Nmp组大鼠的平均逃避潜伏期明显短于Mod组(P<0.05)， N-ace组与Mod组的逃避潜伏期无显著差异(图1A)。此外，Mod组在目标象限的停留时间明显短于Sham组，但Ace组(P<0.05)和Nmp组(P<0.05)的大鼠在目标象限的停留时间明显高于Mod组(图1B)，而N-ace组(P<0.05)的大鼠在目标象限的停留时间明显高于Mod组(图1B)。同时，Mod组大鼠过平台次数少于Sham组，大于Ace、Nmp组(P<0.05)和N-ace组(P<0.05)(图1C)。这些结果表明我们成功地建立了VD大鼠空间记忆和学习障碍模型。穴位埋线能显著改善VD大鼠空间记忆和学习功能障碍，而非穴位埋线对VD大鼠相关功能的改善作用较弱。

穴位埋线可减轻VD大鼠海马神经元的病理性损伤

我们通过HE染色进一步评估了大鼠海马神经元的病理变化，染色结果如图2所示。假组大鼠海马锥体细胞具有完整的形态和形态结构清晰，边缘清晰，排列整齐、紧密，染色均匀，细胞核大（近似圆状），核仁明显，细胞质丰富。但Mod组海马锥体细胞形态不规则、松散，细胞边界模糊，排列相对无序，正常细胞和坏死神经元数量减少，细胞膜和核膜不清楚，细胞核形状不规则。颜色变浅，核仁集中，染色较深，细胞质浑浊。提示VD大鼠海马内存在明显的组织病理学损伤和细胞坏死。此外，我们发现Ace组和Nmp组的海马锥体细胞形态规则，边界清晰，层叠清晰，排列有序。与VD模型相比，正常细胞数量明显增加，坏死神经元数量减少，细胞核形状更规则，核包膜和核仁更清晰，细胞质更丰富。HE染色结果显示，穴位植入可减轻VD大鼠海马的病理损伤。

穴位埋线可降低VD大鼠血清IL-1β和IL-6水平

为检测穴位肠线包埋对VD诱导的体内炎症的影响，采用ELISA法检测大鼠血清IL1 β和IL-6水平，结果如图3A、3B所示。海马IL1 β水平(38.5 vs。25.9 pg/L)和IL-6 (75.9 vs。Mod组的54 pg/L)明显高于Sham组的大鼠。Ace、Nmp和N-ace组大鼠海马IL1 β分别下降至30.3、30.4和35。分别为9 pg/L。同时，Ace、Nmp和N-ace组大鼠血清IL-6分别下降至65.9、65.5和70.5 pg/L。提示穴位包埋可抑制VD大鼠血清IL1 β和IL-6水平。

穴位埋线抑制VD大鼠TLR4/MyD88/ NF-rB信号通路

为了初步探讨穴位包埋在VD大鼠体内的抗炎作用的分子机制，我们评估穴位埋线是否与下调VD大鼠海马TLR4/MyD88/NF-κ b信号通路活性有关。测试结果如图4A-4G所示。与Sham组相比，Mod组海马组织中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白水平显著升高（P<0.05）。与Mod组相比，Ace、N-ace和Nmp组大鼠TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白和mRNA水平明显降低（P<0.05）；Ace组和Nmp组之间无显著差异（P>0.05）。这些结果表明，穴位包埋可以抑制4-VO激活的大鼠海马组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活性。

结论

本研究表明，穴位包埋治疗可改善VD大鼠空间学习记忆丧失，减轻海马病理损伤，抑制炎症反应，这可能与抑制TLR4/ MyD88/NF-κB信号通路有关。本研究提出了一种治疗VD的新方法，也可能有助于减轻公共卫生系统的沉重负担。

讨论

中医和现代医学对痴呆症的研究由来已久。经过多年的深入研究，人们认识到血管疾病在痴呆的发生发展中起着重要的作用，并将其定义为VD，其临床表现主要为认知功能障碍和记忆丧失。水迷宫实验结果显示，Ace组大鼠第三象限游泳时间和过平台次数较Mod组明显提高，说明穴位埋线能提高VD大鼠的学习记忆能力。海马学习记忆相关组织的HE染色也显示穴位埋线治疗VD大鼠海马神经元损伤程度小于Mod组。综上所述，穴位埋线疗法可通过抑制VD大鼠海马神经元损伤来改善神经功能损伤。此外，缺血引起的炎症是VD发病的两个主要因素之一(17)。多项研究表明，炎症细胞因子的过度刺激会导致细胞死亡，引起动脉闭塞、神经元损伤和细胞凋亡，从而加重VD(18-20)。Zuliani等人对血浆细胞因子的分析显示，与老年对照相比，VD患者的血液样本中炎症细胞因子IL- 1 β、IL-6和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平较高(21)。采用改良4-VO法建立VD模型大鼠。4-VO诱导的VD模型大鼠出现明显的学习记忆障碍、海马损伤、炎症因子(IL- 1 β、IL-6)上调。这些结果与前人的研究一致(15,22)，表明我们用这种方法成功建立了VD模型大鼠。

近年来，穴位埋入法作为一种中药，对VD的治疗有明显的作用（23,24），但其机制仍有待进一步探索。Chen等发现，穴位埋显著降低VD大鼠平均逃逸潜伏期，增加平台交叉次数，即穴位埋改善VD大鼠空间学习记忆和位置记忆障碍（25）。Tang等人的另一项研究也显示穴位埋埋提高了VD大鼠的学习记忆能力，降低了血清IL- 1β和IL-6水平（26）。我们的研究还表明，穴位埋线和尼莫地平治疗可减轻VD大鼠空间学习记忆损伤，改善神经元结构病变（萎缩和坏死），通过下调IL- 1 β和IL-6抑制炎症，对VD大鼠发挥神经保护作用。

TLR是在自然免疫系统中主要识别病原微生物的受体。当脑缺血发生时，TLRs被激活，发送信号触发炎症反应，并表达大量的促炎细胞因子和粘附因子，导致脑组织损伤（27-29）。TLRs有很多分类，其中TLR4分布在细胞表面，可以通过血管平滑肌细胞和脑内皮细胞表达，刺激炎症物质的分泌，参与和介导炎症损伤（30、31）。MyD88在多种组织和细胞中表达，是TLR信号中的关键连接分子，当MyD88中的死亡结构域和中间结构域同时表达时，它可以激活下游的NF-κ B，这在传递上游信息和疾病的发生发展中起着重要作用（32,33）。因此，我们提出了一个假设：TLR4/MyD88/NF-κB介导的炎症信号通路参与了VD中穴位包埋的过程。为了验证这一假设，我们检测了TLR4、MyD88和NFκB的mRNA和蛋白的表达。结果显示，穴位埋和尼莫地平治疗可降低VD大鼠海马TLR4、MyD88和NF-κB的表达，说明穴位埋抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活性。

中西合璧述评： 该研究论述了穴位埋线下调炎症因子的释放，抑制了海马神经元的损伤，进而恢复了VD大鼠的学习记忆功能。然而，本研究只是对VD穴位包埋治疗机制的初步探索，并没有进行实验来验证穴位包埋通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症反应，从而减轻VD大鼠的学习记忆损伤和病理损伤。此外，穴位包埋术对不同年龄、性别的VD高危人群的治疗效果是否不同尚不清楚，从而制定不同的精细化干预措施，更好地恢复其学习记忆障碍。穴位埋线的确切分子机制及治疗效果有待进一步的实验研究。 

编译：金广宇

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