【醉仁心胸】猪模型中脊髓刺激通过GABA能信号通路降低心率失常的发生

编译：周阳宁 等   ；审校：董榕  

上海交通大学医学院附属瑞金医院北部院区麻醉科

摘要  

背景

包括脊髓刺激在内的神经轴调节，可减少心脏交感神经兴奋和室性心律失常。但其产生作用的分子机制仍不清楚。作者假设脊髓电刺激通过γ-氨基丁酸（GABA）介导的胸脊髓通路减少心肌缺血诱发的交感兴奋和室性心率失常。

方法

本研究使用约克郡猪作为模型，随机分为对照组（n=11），缺血组（n=11），再灌注组（n=16）、缺血再灌注加脊髓刺激组（n=17）、缺血再灌注加脊髓刺激加GABAA或GABAB受体拮抗剂组（GABAAn=8，GABABn=8）、缺血再灌注加GABA转氨酶抑制剂组（n=8）。放置四极脊髓刺激导线至硬膜外（T1-4）。GABA调节药物从鞘内给药。缺血前30分钟起使用50Hz电刺激。采用56电极网进行高分辨率电成像记录电生理过程。免疫组化和免疫印迹测定GABA受体在胸脊髓中的表达。

结果

心肌缺血引起心交感兴奋，伴有激活恢复间隔缩短（mean ± SD, –42 ± 11%），脊髓电刺激使该影响减弱（-21±17%，P=0.001）。GABAA和GABAB受体拮抗剂会消除脊髓电刺激对交感兴奋的抑制（与缺血再灌注加脊髓电刺激相比，GABAA，-9.7±9.7%，P = 0.043;与缺血-再灌注加脊髓刺激相比，GABAB组为-13±14%，P = 0.012），而GABAculine单独使用可带来与脊髓电刺激相似的结果（-4.1±3.7%，P = 0.038）室性心率失常评分结果也支持这些结论，缺血再灌注时，脊髓电刺激增加了缺血再灌注中GABAA受体的表达，而未增加GABAB受体表达。

结论

胸段脊髓电刺激通过激活GABA信号通路，减少缺血再灌注引起的交感兴奋和心率失常。这些数据支持了脊髓刺激诱导的GABA释放激活抑制性中间神经元以减少从浅表背角到中外侧核交感输出神经元的初级传入信号的假设。

自主神经系统失调在心肌缺血引起室性心律失常和心源性猝死的病理生理中起重要作用。在激活后，胸椎脊髓背角的神经突触启动复杂的心脑神经回路和反射传出交感神经兴奋。脊髓交感神经系统输出的增加导致心脏电生理的急性改变以及胸内、心外神经节和心内神经系统的长期神经元重塑。

神经调节疗法与高位胸脊髓电刺激被证明有抗心率失常作用。脊髓刺激疗法被认为可抑制心肌缺血引起的交感信号，稳定心脏传出信号的流出，从而减少缺血期间的室性心律失常。我们和其他人之前报道过脊髓刺激疗法可以通过减少局部缺血引起的心交感神经激活来改善室性心律失常和心功能。然而，脊髓滴剂调节神经信号和心脏交感神经兴奋的机制尚未阐明。

脊髓刺激可能影响脊神经信号的一种可能机制是γ-氨基丁酸（GABA）介导的途径。GABA通过激活GABAA型和GABAB型受体发挥作用。这两种亚型的受体均存在于脊髓中，受体亚型之间的结构、解剖位置和功能存在重要差异。在啮齿类动物的神经痛模型中，脊髓刺激通过背角释放GABA产生作用。在临床上，鞘内使用GABAB受体激动剂可以增强对脊髓刺激无反应受试者的反应。进一步研究GABA能通路在疼痛中的作用，文献发现周围神经损伤和脊髓刺激模型对GABAA、GABAB受体的反应存在差异。

因此，本研究的目的是确定GABA在心肌缺血再灌注期间脊髓刺激降低交感兴奋和室性心律失常治疗效果中的作用。我们假设脊髓刺激通过GABA介导的胸脊髓通路减少室性心律失常。我们的主要目的是确定有无脊髓刺激时GABA对缺血再灌注期间心交感兴奋和心律失常的影响。通过一系列功能试验，药物阻断或增强脊髓中的GABA受体，在大动物猪模型中量化脊髓刺激对心交感兴奋和心率失常的影响。其次，考虑到脊髓刺激对GABA受体介导的通路可能有不同影响，我们研究了脊髓中两种亚型受体的变化。这些可以为脊髓刺激对室性心律失常保护作用提供数据支持，有助于进一步了解脊髓刺激治疗的临床作用。

材料和方法

本研究方案已经过伦理委员会的批准，实验按相关规定进行。

实验方法

实验方法概述和时间表如图1所示。本研究选用约克郡猪，共68头，公、母各34头，平均年龄4月。第一阶段中，动物被随机分为3组，对照组、缺血再灌注组、缺血再灌注加脊髓刺激组，建立有无脊髓刺激的急性缺血模型。然后在第二阶段，动物们被分为6组，分别为：对照组（n=11），缺血再灌注组（n=16），缺血再灌注+脊髓刺激（n=17），缺血再灌注+脊髓刺激+GABAA受体拮抗剂（n=8），缺血再灌注+脊髓刺激+GABAB受体拮抗剂（n=8），缺血再灌注+GABA转氨酶抑制剂（GABAculine，n=8）。实验方案完成前，缺血再灌注+脊髓电刺激+GABAB受体拮抗剂组有1例动物死亡。该组共报告7只动物的数据。对照组动物的手术准备和时间过程与实验组相同，但未进行心脏缺血或脊髓刺激。在缺血再灌注组和缺血再灌注+脊髓刺激组，动物均放置脊髓刺激导线并进行心脏缺血干预，但在实验过程中，只有缺血再灌注+脊髓刺激组进行刺激。在GABAA和GABAB拮抗剂组，放置鞘内和脊髓刺激导线，进行脊髓刺激治疗，行心脏缺血处理。GABAculine组，置入鞘内和脊髓刺激导管，不开启刺激，使用GABA转氨酶抑制剂，行心脏缺血处理。

动物准备

动物实验准备如前所述进行，使用替拉唑镇静，插管、供氧气行机械通气。术中使用吸入异氟醚（1-3%）维持全麻。实验中全称监控记录心率和心电图。在颈动脉和股动脉插管监测血压。颈静脉、股静脉插管，静脉输注生理盐水（10ml/kg）并给药。根据每小时检测的动脉血气结果调整通气维持酸碱平衡。使用外部供暖维持体温。动物取俯卧位，行部分椎板切除显露脊髓。后将其置于仰卧位行胸骨正中切开，显露心脏。准备完成后，将动物置于左侧卧位，改为静脉麻醉，使用α-氯蔗糖静脉推注维持（50mg/kg初始计量，20mg/kg.h维持）。该方案已被证实对自主神经系统活动影响最小，并广泛使用。实验全程中，监测角膜反射、下颌骨张力和血流动力学指标评估麻醉深度。实验结束后动物被注射氯化钾安乐死。

急性心肌缺血模型

如前所述，我们制造了急性心肌缺血模型。使用Prolene缝线，在冠状动脉左前降支（LAD）的第二对角支下进行套扎。结扎冠脉，引起心肌缺血并维持1小时。用ST段抬高证实发生心肌缺血。缺血1小时后，或当猪出现不可复苏的无脉性室性心动过速或室颤时（除颤10次后未复率），拆除缝线，再灌注2小时。当缺血期间发生无脉性室性心动过速或室颤时，使用高级生命支持（ACLS）对动物进行复苏。

脊髓电刺激

硬膜外腔置入四极脊髓刺激引线，位于胸椎的T1-4，引线的最头极位于T1。电流控制器在缺血前30分钟起，以50Hz的0.4ms脉冲持续，在缺血再灌注方案中全称维持。刺激电流设定在运动阈值的90%，每2Hz频率增加刺激强度，0.4ms脉冲维持，直到观察出肩部肌肉收缩。平均运动阈值为1.3±1.0mA。

鞘内给药GABAA/B受体拮抗剂和GABA转氨酶抑制剂

GABA受体拮抗剂和GABA转氨酶抑制剂通过第5胸椎阶段硬脊膜小切口置入的鞘内导管给药，导管置入与T1至T4。根据文献选择最低剂量（GABAA拮抗剂Bicuculline 1000ug或GABAB拮抗剂CGP55845 3000ug溶于2ml生理盐水中，用注射泵维持5分钟以上）。考虑到鞘内给药30分钟后出现背角药物浓度峰值，在缺血再灌注开始前30分钟使用药物，每隔60分钟再次灌注。GABAculine被用来抑制GABA转氨酶，减少GABA讲解，导致神经元GABA浓度增加。GABAculine在缺血再灌注前30分钟，在无脊髓刺激的情况下，使用注射泵推注2mg，时间超过5分钟，每隔60分钟再灌注一次。

血流动力学评估和体表心电图记录

我们进行了血流动力学评估和心电监护记录，在整个实验过程中监测左心室收缩期和舒张期压力。我们使用12极导联，将高保真压力监测导管经左颈动脉插入左心室，并连接MPVS超压容积回路系统。以收缩压和最大压力变化率评估左室收缩功能，以舒张压和最小压力变化率评估左室舒张功能。在Prucka CardioLab系统上连续记录心电数据。

电生理记录与分析

在心脏周围放置一个56电极尼龙网，使用Prucka测量单极电图，详见图2。在基线、脊髓刺激时、急性缺血时和再灌注2小时内记录所有生理指标。我们分析评估了激活恢复时间，该指标已被证明可替代局部动作电位持续时间，激活恢复时间使用定制软件计算。交感神经刺激与较短的激活恢复时间相关。本研究通过全心及局部心肌缺血区、非缺血区分析激活恢复时间，局部缺血以冠脉左前降支分布是否有灌注进行定义。计算缺血心肌的百分比作为心室内的危险面积。为了确保激活恢复时间测量的准确，每个ST段变化的心电图都由半自动软件测量，按照Haws和Lux描述的缺血激活恢复时间测量指南手工检查，并仔细这里4~5次跳动。所有电生理和血流动力学测量均由研究人员离线进行，对实验分组不知情。从基线到记录结束，以盲法每15分钟计算一次测量值。

基于心电图的心律失常评分系统和个别心律失常

使用Prucka CardioLab系统统计室性心律失常，包括室性早搏、室性心动过速和室颤。室性早搏通过存在QRS波早搏复合体确定，室性心动过速根据Lambeth定义进行划分，分别为三次或三次以上的连续室性早搏。对每只动物在缺血和再灌注过程中进行心律失常评分。为了便于计算，我们采用了一种基于临床的改良心电图评分方法。我们将评分定义为：0，无室性早搏、室性心动过速、或室颤；1，室性早搏；2,1~5次室性心动过速；3，室性心动过速5次以上或室颤1次以上；4，2~5次室颤；5,5次室颤以上。评分系统根据心律失常的严重程度给出一个数值，分数越大表示越严重。

心脏缺血区（危险区）的染色及测量

为了确定潜在的缺血损伤，用Evans蓝对心脏进行染色。实验结束、在动物处死后，再次收紧LAD结扎，将动物取仰卧位，在心脏基部正上方的主动脉上方放置十字钳。我们确保主动脉是完全封闭的，防止染料泄露出心脏。Evans蓝染料是通过十字钳下方穿刺的针进行注射，从心里漏出来。危险区被定义为未被Evans蓝染色的区域。

免疫组化和图像分析

用胸椎T3切片，GABAA和GABAB受体抗体双标记，测量缺血再灌注时胸椎脊髓中GABA神经元的变化。组织采集后置于4%多聚甲醛中，并存放在-80℃的冰箱中。冷冻样品用冷冻恒温器切割成35μm厚度，然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗，用5%山羊或驴血清阻断液在室温下阻断1小时。切片先用抗GABAA抗体或抗GABAB抗体在含0.3% Triton X-100溶液的磷酸盐缓冲盐水中4℃孵育一夜，然后转入抗神经元核抗体溶液中4℃孵育一夜，再用磷酸盐缓冲盐水中二抗。每次抗体孵育后，切片漂洗3 ~ 4次(每次5分钟)。在它们被安装和覆盖安装介质之后，切片采用尼康Eclipse Ti2倒置显微镜系统和NIS-Elements AR成像软件v . 5.10.01进行成像。脊髓切片用×20物镜成像。所有的暴露时间和处理程序在样品和处理组之间是相同的。

在整个分析过程中，研究人员对实验组脊髓切片不知情，进行图像分析，并对方案进行标准化处理，以避免潜在的实验偏差。图像分析使用NIS-Elements AR Analysis Software v 5.10.01完成。每只动物至少使用两个脊髓切片。脊髓被划分为左和右感兴趣的区域，免疫反应细胞的数量根据组间统一设置的阈值进行计数。取每只动物的平均数据，并按分组和解剖区域进行分析。

Western Blot

为了进一步定量评价脊髓GABA受体的表达，我们从T3背角提取蛋白，采用Western blot检测GABAB受体亚型- GABAA α受体、GABAAβ受体、GABAB受体1和GABAB受体2的表达。猪新鲜脊髓组织湿冰解剖，液氮速冻，使用前存放在-80°C冰箱中。冷冻组织的背侧在冰冷的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中机械匀浆，其中含有1X Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。匀浆在4°C下以14000转/分钟离心10分钟，上清部分根据制造商的说明使用Bradford Assay试剂盒测量蛋白浓度。使用Tris-Glycine Sodium Dodecyl Sulfate运行缓冲液，在200V电压下冰敷1小时，将总蛋白浓度10µg应用于4 - 20%的Tris-Glycine eXtended预制蛋白凝胶。然后转移到聚偏氟乙烯膜，在4°C, 100电压下30分钟。用含有0.05% Tween的SuperBlock阻断缓冲液(Thermo Fisher Scientific)在室温下封闭膜1.5 h，然后在4°C进行一抗。为检测一抗信号，成像前应用辣根过氧化物酶偶联二抗和增强的化学发光检测试剂。然后用Western blot剥离缓冲液剥离膜10分钟，阻断后用甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体孵育1小时。甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达被认为是一个对照，用来规范目标蛋白的强度水平。在图像分析系统(ChemiDoc XRS + system, Bio-rad)中捕捉膜，使用图像分析系统中捕获的图像分析程序通过密度法对条带进行量化，使用图像分析程序通过密度法对条带进行量化。

统计学分析

所有数据均采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。正态分布的数据用均数±标准差表示，非正态分布的数据用中位数和四分位数范围表示。对组内所有心脏电生理(激活恢复间隔)和血流动力学测量均采用单因素重复测量方差分析和事后Tukey试验。采用混合效应模型评估各组间心脏电生理(激活恢复间隔、心律失常评分)和血流动力学变量。我们使用混合效应模型来检验时间点(重复测量)对测试条件下的原始值的影响，其中受试者人数被视为随机效应，风险区域百分比和性别被视为固定效应。我们使用混合效应模型来比较基线测量值的百分比变化，在控制性别和缺血区域风险百分比的条件下，其中条件作为类别变量进入模型。免疫组化和Western blot分析采用单因素方差分析和事后Tukey检验比较各组间GABAA/B阳性神经元百分率和GABAA/B受体亚单位浓度。对于所有结果，P值< 0.05被认为具有统计学意义。所有的图形都是使用GraphPad Prism软件创建的。样本量的计算基于初始数据，在对照组和脊髓调节期间，平均激活恢复间隔为450 ms，与此平均值的变化为20%，SD为65，双尾alpha 0.05，在急性缺血期间的功率为80%，这决定了样本量n = 8 /实验组。

结果

缺血再灌注降低整体激活恢复时间

在基线、控制30分钟、控制60分钟或脊髓刺激30分钟和LAD 30分钟时报告心脏电生理测量。报告30分钟时的缺血数据，因为多只动物在缺血过程中出现不可收缩性室性心动过速/心室颤动需要复苏，导致60分钟时数据集不完整。比较各组不同时间点的心脏电生理指标，除未发生心肌缺血-再灌注的对照组外，所有实验组均发现心肌缺血可导致预期的心脏交感神经兴奋，激活恢复间隔时间缩短(表1)。各组血流动力学参数比较，GABAA组缺血后HR升高，脊髓刺激降低缺血时左室压的最大升高速率。其他血流动力学无明显变化(表2)。

缺血再灌注降低缺血心肌火花恢复时间的百分比变化

分析心肌缺血区和非缺血区激活恢复时间，比较五组心肌缺血-再灌注过程中心脏电生理指标的变化:缺血再灌注+脊髓刺激、缺血再灌注+脊髓刺激+ GABAA受体拮抗剂(GABAA)、缺血再灌注+脊髓刺激+ GABAB受体拮抗剂(GABAB)、缺血再灌注+ GABAculine。心脏缺血性损伤的程度是通过心脏的危险区域来测量的。两组间危险面积无差异(缺血再灌注，22±12%;缺血再灌注加脊髓刺激，26±13%;GABAA, 31±10%;GABAB, 25±8%;GABAculine, 22±9%;均P > 0.207;数据以平均值±SD表示)。缺血诱导的交感神经兴奋程度由从基线到LAD结扎30分钟的激活恢复时间的变化决定，两组之间进行比较，以观察心肌缺血时单独脊髓刺激与脊髓刺激加GABA拮抗剂和GABAculine的效果。心脏缺血降低了缺血区域的激活恢复时间，脊髓刺激缓解了激活恢复时间的减少(图3A)。两种鞘内GABA受体拮抗剂均可消除脊髓刺激对缺血心肌活化恢复间隔缩短的影响(GABAA, P = 0.043 vs.脊髓刺激;GABAB, P = 0.012 vs.脊髓刺激)。而单独应用GABA转氨酶抑制剂可使激活恢复时间缩短，其幅度与脊髓刺激相似(图3A)。两组间在非缺血区未见激活恢复时间变化(图3B)。

心肌缺血30min时，两组间血流动力学参数、收缩压、左室压最大上升速率(delta压/delta时间最大值)无差异。然而，GABAA组的HR高于脊髓刺激组和GABAB组(P = 0.018 vs.脊髓刺激;P = 0.019 vs. GABAB)。此外，GABAculine组左室压的最大上升速率大于对照组和GABAA组(P = 0.043;P = 0.022 vs. GABAA;表1)。

缺血再灌注期间室性心律失常评分的变化

计算缺血和再灌注期间的室性心律失常评分，并在所有实验组之间进行比较。心律失常评分越高，表明心律失常的严重程度越高。缺血再灌注与心律失常评分升高相关，而缺血时脊髓刺激可降低心律失常。

在缺血再灌注期间，GABAculine治疗也可降低心律失常评分，效果与脊髓刺激相似。另外，脊髓刺激加两种鞘内GABA受体拮抗剂可抵消心肌缺血再灌注时脊髓刺激对心律失常评分的降低(图4)。

缺血-再灌注降低了GABAA受体的表达，而这种降低在脊髓刺激时更少

免疫组化

如图5所示，心脏缺血-再灌注显著减少了GABAA受体加神经元(量化为与GABAA受体共定位的神经元核阳性细胞的百分比)。缺血再灌注时脊髓刺激比单纯缺血再灌注时显示GABAA +神经元的比例更高；然而，该表达仍低于对照组。相比之下，在缺血-再灌注过程中，有或没有脊髓刺激时，GABAB受体加神经元的表达没有变化(图6)。GABA受体在背角浅表层(I ~ II)、深层层(III ~ VII、X)和中间外侧细胞柱的解剖分布如图7所示。与单纯缺血再灌注相比，在所有解剖区域，缺血再灌注加脊髓刺激的GABAA +神经元表达量都更高(图7)。缺血-再灌注与缺血-再灌注加脊髓刺激相比，每个解剖区域GABAB +神经元的百分比无差异(缺血-再灌注:浅表，25% [15-51];深度，14% [4-37];中外侧核，11% [5-35]vs缺血-再灌注加脊髓刺激:浅表，26% [12-35];深, 18% [4-31];中外侧核，9% [5-14];P < 0.05)。

Western Blot。

心肌缺血不影响GABA受体亚型的表达。然而，在脊髓刺激缺血再灌注期间，GABAA α受体、GABAAβ受体亚型的表达高于对照组和缺血再灌注(图8)。脊髓刺激没有影响GABAB受体亚型的表达。

讨论

在本研究的猪胸椎脊髓刺激心肌缺血-再灌注损伤模型中，我们发现(1)在心脏缺血期间进行脊髓刺激治疗可降低心肌交感兴奋和室性心律失常，(2)脊髓刺激治疗期间鞘内阻断GABAA和GABAB受体可消除脊髓刺激的心肌保护作用，增加交感神经兴奋和心律失常，(3)鞘内给予GABA转氨酶抑制剂(GABAculine)可降低心肌缺血再灌注时的心肌交感兴奋和室性心律失常，其幅度与脊髓刺激相似;(4)心肌缺血时脊髓刺激神经调节与GABAA受体表达显著增加相关，而GABAB受体表达无显著变化。因此，这些结果重要地表明，脊髓刺激可能通过激活脊髓GABA能通路来降低缺血再灌注诱导的交感兴奋和心律失常。

本研究的心脏电生理结果支持我们缺血诱导的心脊髓神经反射激活模型，以及胸椎脊髓刺激在调节交感神经输出和减少心律失常方面的治疗效果。缺血敏感心脏神经元的细胞体位于胸段背根神经节，并投射到胸廓脊髓的背柱，在那里它们激活一个复杂的心脊神经反射回路，这导致交感神经节前神经元的传出输出增加。本研究的结果和以往的报道表明，通过脊髓刺激进行神经调节可以中断脊髓心反射回路，从而降低缺血心肌局部交感神经兴奋，降低致死性室性心律失常。

虽然GABA介导的通路与脊髓刺激的镇痛机制有关，但对GABA信号在脊髓刺激治疗中减少心肌缺血诱导的交感兴奋和心律失常的作用知之甚少。脊髓中的GABA抑制信号转导主要是通过激活GABAA或GABAB受体来实现的，这两种受体在结构、解剖位置和功能上有重要的差异。从结构上看，GABAA受体是配体门控的氯离子通道，而GABAB受体是g蛋白偶联受体。从解剖学上看，GABAA受体均匀分布于整个脊髓，而GABAB受体则集中在背角I - III层，可作为自受体，在突触前作用于突触于初级传入纤维上的GABA含中间神经元 (图1)。

在功能上，这两种受体介导初级传入纤维的突触前抑制和脊髓反射的神经元调节。GABAA受体已被发现介导GABA诱导的抑制中持续时间较短的成分，而GABAB受体介导持续时间较长的脊髓反射。此外，有证据表明GABAA和GABAB受体在神经损伤和脊髓刺激反应中的表达差异。因此，为了确定GABA信号通路在脊髓刺激中的作用，我们评估了(1)药物阻断GABAA和GABAB受体的功能效应，以及(2)在脊髓刺激过程中GABA受体亚型表达的个体变化。

我们的结果表明，在心脏缺血再灌注时，脊髓刺激引起的心肌交感兴奋和室性心律失常的降低可通过鞘内给予GABAA和GABAB受体拮抗剂而消除。此外，鞘内单独使用GABA转氨酶抑制剂(GABAculine)可提供类似于脊髓刺激治疗的心脏保护。减少GABA降解、导致神经元GABA浓度增加的这些结果表明，GABA拮抗剂对脊髓刺激治疗效果的消除，而GABA转氨酶抑制剂对脊髓刺激的治疗效果加强。这有力地证明了脊髓刺激神经调节是通过激活脊髓神经网络中的GABA能信号传导机制来减弱的缺血诱导的交感神经兴奋。

有趣的是，虽然我们发现药物阻断GABAA和GABAB受体的功能效果没有差异，但免疫组化分析显示，心脏缺血和脊髓刺激时，GABAA和GABAB受体蛋白表达存在差异。我们发现心脏缺血与GABAA +神经元的减少有关，而缺血+脊髓刺激导致GABAA +神经元的增加。在GABAB +神经元中，无论是单纯缺血再灌注还是缺血再灌注+脊髓刺激，均未见差异。采用Western blot对GABAA和GABAB受体亚型表达进行了定量分析，结果进一步支持了与免疫组化的差异。缺血再灌注加脊髓刺激均增加了GABAA α和GABAAβ亚基表达，而在缺血再灌注加或不加脊髓刺激时GABABR1和GABABR2亚基表达均无差异。

通过对GABAA上调神经元的解剖分布的研究发现，与单纯缺血相比，在缺血刺激脊髓时，GABAA神经元在背角的浅层和深层以及中间外侧细胞柱中都有所增加。浅表背角薄层中的GABAA受体可能抑制突触前心肌缺血敏感的初级传入神经递质释放。而在更深层和中间外侧细胞柱中GABAA神经元的上调可能代表了抑制性GABAA能中间神经元的激活，这些中间神经元是交感神经节前神经元的突触前神经元。这项研究建立在我们之前使用Cfos进行神经元激活的工作的基础上，在那里我们报道了脊髓刺激激活胸背角深层椎板中的中间神经元。这些深层椎板中的抑制性中间神经元(V, VIII和X)已被证明与交感神经节前神经元的突触有关，调节向心脏输出的交感神经输出。

我们发现，GABAA或GABAB受体拮抗剂对GABA受体亚型表达的差异在功能作用上没有差异，这与之前关于GABA信号通路在伤害性感受通路中的研究结果相似。虽然Castro-Lopes等人报道了GABAB受体结合下调和GABAA受体结合上调的啮齿动物外周损伤模型，但Gwak等人和Malan等人的项后续研究发现，GABAA和GABAB受体激动剂和拮抗剂均有类似的功能反应。GABA亚型受体激动剂均可诱导镇痛，GABAA和GABAB拮抗剂均可引起神经损伤时的痛觉过敏和异位痛。

GABAA和GABAB受体拮抗剂在缺血时逆转脊髓刺激治疗效果表明，脊髓刺激可能通过增加脊髓内源性GABA张力来减少传出交感神经输出。我们的发现进一步证实了这一点，GABAculine可以抑制GABA降解并增加神经元GABA浓度，导致缺血诱导的心脏交感兴奋和室性心律失常的减少，类似于脊髓刺激。另外，这两种GABA受体亚型拮抗剂的类似功能反应也可能是由于以下原因之一：(1)鞘内药物受体拮抗剂可阻断已经表达的GABA受体，因此脊髓刺激对GABA受体表达的影响可能与阻断GABA受体的作用无关； (2)GABA受体表达受神经递质水平变化的影响。因此我们无法确定GABA受体表达的变化是由于脊髓刺激对受体上调的直接影响，还是由于GABA神经递质释放/摄取的变化。

局限性

虽然本研究为心肌缺血时脊髓刺激神经调节作用的机制提供了新的见解，但仍存在局限性。在本研究中，对正常心脏进行急性缺血，以确定GABA信号通路在结构正常的中枢神经系统中对脊髓刺激的影响。这些结果可能不适用于患有慢性梗死或心力衰竭的心脏，因为在这些心脏脊髓神经网络中可能存在不良的重构。此外，考虑到所使用的开胸模型，整个实验过程中都需要持续麻醉。正如之前报道的，许多全身麻醉药物都是由GABA通路介导的，包括α-氯蔗糖，它对自主神经系统的影响较小，被用于许多动物实验。因此，虽然有可能α-氯蔗糖会影响GABA受体的表达，但本研究是在所有实验组的手术准备过程中使用相同浓度的α-氯蔗糖进行的，因此所看到的任何影响在所有实验组都是相似的。而GABA受体表达变化的组间差异可能不会受到影响。

综上所述，我们证明急性心肌缺血-再灌注时胸椎脊髓刺激通过激活GABAA信号通路降低心肌交感兴奋和室性心律失常，其作用可能是减少浅表背角的初级传入信号，激活抑制性中间神经元，从而减少胸廓脊髓交感神经节前神经元的交感输出。这些发现有助于阐明脊髓刺激神经调节减少心肌缺血诱导交感神经输出的途径，并有助于未来的研究，以提高临床脊髓刺激减少心肌心律失常的疗效。

点评：

我们在临床工作中，尤其是在心胸外科手术中，经常会遇到各种心律失常的患者。可以通过加深麻醉抑制交感兴奋、甚至是阻滞交感神经等方法进行干预。但对植物神经功能进行调节产生作用的机制仍不甚了解。本研究为我们揭示了交感神经对心脏影响的机制之一，同时也为基础研究与临床研实践相结合做出了很好的示范。

周阳宁 等 编译  

董榕 审校

参考文献：  

Kimberly Howard-Quijano,Yuki Kuwabara, Tomoki Yamaguchi, Kenny Roman, Siamak Salavatian, Bradley Taylor, Aman Mahajan; GABAergic Signaling during Spinal Cord Stimulation Reduces Cardiac Arrhythmias in a Porcine Model. Anesthesiology 2023; 138:372–387 doi: https://doi.org/10.1097/ALN.0000000000004516

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