1区8+！卵巢癌免疫相关研究~

导语：免疫疗法彻底改变了癌症治疗和免疫学领域，但在高级别浆液性卵巢癌 (HGSOC) 中的治疗效果有限。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者描述了 HGSOC 的免疫基因组景观并完善了 HGSOC 的免疫学分类。文章发表在《British Journal of Cancer》上，影响因子为8.8，文章题目为：Immuno-genomic characterisation of high-grade serous ovarian cancer reveals immune evasion mechanisms and identifies an immunological subtype with a favourable prognosis and improved therapeutic efficacy。

数据介绍

本研究分析了 495 个 TCGA HGSOC 肿瘤的多组学数据和 1708 个 HGSOC 肿瘤的 RNA-seq 数据。 

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01、免疫微环境是癌症预后的关键决定因素  

为了确定与临床结果相关的转录特征，本研究首先使用来自 16 项研究的 2203 个 HGSOC 样本的基因表达谱构建了与 OS 相关的基因概要。

图 1a 概述了识别可靠预后基因的分析策略。接下来本研究对每个数据集中的阶段、年级和年龄的基因表达进行了多因素 Cox 回归分析，然后使用荟萃分析整合结果，以利用所有 16 项研究的预后价值。共有 1142 个基因被确定为有利的预后基因，1863 个基因被认为是与不良预后相关的危险预后转录特征。然后，本研究对这些有利和危险的预后基因进行了通路富集分析，结果显示有利和危险的预后基因之间存在功能异质性。如图1b所示，功能表征的结果表明，风险预后基因在癌症侵袭和转移相关通路中富集，例如细胞增殖和细胞死亡，而有利预后基因在免疫相关通路中占主导地位，例如如T细胞激活、T细胞增殖、淋巴细胞迁移和细胞因子介导的信号通路（图1b）。这些结果表明，免疫微环境是促成良好预后的关键决定因素。

图 1

为了进一步检查肿瘤免疫微环境 (TIME) 中免疫浸润的哪些细胞组成影响患者预后，本研究通过对每个数据集中部分具有OS的个体浸润免疫细胞类型进行单因素Cox回归分析，估计了28个浸润免疫亚群与预后的相关性，然后利用16个数据集进行荟萃分析（图 2a）。荟萃分析的结果揭示了特定浸润免疫亚群与预后之间的关联。如图2a所示，大多数免疫亚群的浸润被观察到与良好的预后相关。其中，与适应性免疫相关的7种免疫亚群，包括活化B细胞、活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞、效应记忆CD4 T细胞、效应记忆CD8 T细胞、滤泡辅助T细胞和1型辅助T细胞与良好的预后显著相关。另一方面，只有一个先天免疫的免疫亚群（CD56 明亮自然杀伤细胞）与良好的预后显著相关（图2a）。浆细胞样树突状细胞（pDC）与不良预后显著相关（图2a）。为了进一步表征 HGSOC 肿瘤内免疫浸润的异质性，本研究根据浸润免疫细胞组成对 HGSOC 肿瘤进行了层次聚类，确定了两个具有不同免疫表型的患者簇。如图2b所示，占大多数HGSOC肿瘤的簇II肿瘤倾向于免疫冷，表现出低水平的免疫浸润，而占一小部分HGSOC肿瘤的簇I肿瘤倾向于免疫热，并与较高水平的免疫浸润相关。据观察，与免疫冷样簇中的患者相比，免疫热样簇中的患者的生存时间明显更长（图2c）。一小部分患者的高免疫原性表明，免疫治疗可能对一些可通过肿瘤免疫基因组特征识别的 HGSOC 患者有益。  

图 2

02、基因组状态影响HGSOC肿瘤的免疫表型  

为了表征肿瘤内免疫状态，本研究首先使用基于使用 GSEA 方法评估的免疫浸润的细胞组成的基因组数据对 TCGA HGSOC 肿瘤进行无监督分层聚类。

总共鉴定出四个具有不同免疫表型的簇（图3a）。如图 3a 所示，免疫浸润从簇 C1 到 C4 增加。C1簇中的肿瘤表现出最低水平的免疫浸润，因此被指定为免疫冷HGSOC肿瘤，而C4簇中的肿瘤表现出最高水平的免疫浸润，因此被指定为免疫热HGSOC肿瘤。观察到 C2 和 C3 簇中的肿瘤具有中等水平的免疫浸润，因此被合并并指定为免疫中HGSOC肿瘤。通过分析分子亚型与四个簇的关联，本研究发现了分子亚型的独特分布，该分布表征了四个簇。簇 1 几乎完全由增殖亚型组成，簇 4 主要由间充质亚型和免疫反应亚型组成。

为了描述免疫热HGSOC肿瘤的基因组特征，本研究比较了免疫冷和免疫热HGSOC肿瘤的基因表达模式，以确定上调和下调的基因(图3b)。

细胞带富集分析显示，这些免疫表型相关的DEG在若干染色体带中显著富集，这些染色体带中有特定的必需免疫基因，如JAK1、PD1和IFNGR1/2。本研究绘制了整个基因组中C1和C4簇的拷贝数状态，并揭示了CNVs与免疫表型之间的显著关联。如图3b所示，在富集的染色体带中观察到频繁的拷贝数缺失或扩增。在1、4、5、9、21和22号染色体上，基因在免疫冷的HGSOC肿瘤中倾向于拷贝数缺失，而在2、3、13和20号染色体上，基因在免疫冷的HGSOC肿瘤中相对于免疫热的HGSOC肿瘤中可能被扩增。特别是，在免疫热的HGSOC肿瘤中，染色体位点4q21.1和4q13.3经常发生拷贝数缺失，这与上述观察结果一致，即免疫热的HGSOC肿瘤中上调基因倾向于在这些染色体区域富集。

通过根据CXC趋化因子家族成员和IFNGR1的GISTIC值对肿瘤进行排序，本研究发现CXC趋化因子的CNV模式可用于将肿瘤分为三组：完全缺失、部分缺失或无缺失的肿瘤。

本研究检查了三组中GZMA和CD8A的表达模式，发现GZMA和CD8A的表达分布存在显著差异（图3d） 。GZMA 和 CD8A 的表达水平通常与编码 CXC 趋化因子的基因缺失的减少有关。如图3d所示，CXC趋化因子基因未缺失的肿瘤中GZMA和CD8A的表达显著高于完全缺失和部分缺失的肿瘤。这些结果表明这些基因的拷贝数丢失可能是这些肿瘤免疫浸润相对较低的原因。

为了确定同源重组缺陷(HRD)是否与免疫表型相关，本研究通过估计不同免疫亚群的浸润来检测肿瘤的BRCA1/2基因型是否与免疫表型相关。

如图3e所示，与野生型肿瘤相比，大多数免疫亚群在BRCA1/2突变肿瘤中富集。此外，BRCA1/ 2突变在其他HR缺陷肿瘤中也观察到类似的结果，其浸润白细胞水平明显高于HR完整肿瘤(图3f)。此外，相对于免疫冷簇，免疫热簇中更容易出现HR缺陷肿瘤(图3g)。这些结果表明，HRD基因型与高活性免疫表型相关，非HRD基因型与免疫抑制表型相关。

图 3

据报道，肿瘤免疫原性是内在免疫逃逸的一个关键方面。因此本研究进一步研究了突变负荷和新抗原与 HGSOC 肿瘤免疫表型的关系。HGSOC 肿瘤首先被分为两组：高突变负荷肿瘤和低突变负荷肿瘤。如图4a所示，与低突变负荷的肿瘤相比，高突变负荷肿瘤的TME中，效应细胞(如活化CD4和T细胞)的比例明显过高，这与高突变负荷与患者生存率提高相关的观察结果一致（图 4b）。此外，与低突变负荷的肿瘤相比，高突变负荷的肿瘤表现出明显更高水平的淋巴细胞浸润和新抗原负荷，如图 4c 所示。然而，不同免疫表型的HGSOC肿瘤中癌种系抗原的表达没有显著差异（图4d）。对内源性逆转录病毒（ERV）表达模式的进一步研究表明，ERV表达可用于将HGSOC肿瘤分为两组，如图4e所示，观察到第 2 组中具有高水平 ERV 表达的 HGSOC 肿瘤的免疫细胞、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 和溶细胞活性富集度较低（图 4f、g）。

图 4

03、化疗调节HGSOC肿瘤的免疫微环境  

为了研究化疗对 HGSOC 肿瘤免疫微环境的影响，本研究首先收集了 14 名 HGSOC 患者新辅助化疗前后的配对样本。14例患者的免疫组化染色结果显示，新辅助化疗后患者的CD8+ T细胞密度和CD8/CD3比值相对于治疗naïve组显著增加(图5a)，提示化疗诱导了效应免疫细胞的浸润。为了进一步验证这一发现，本研究比较了来自 GSE15622 队列的 25 个配对 HGSOC 肿瘤在三个周期的卡铂或紫杉醇化疗前后的免疫标记基因表达变化 。如图5b所示，免疫标记基因，尤其是来自效应细胞的免疫标记基因，在化疗后显著上调。例如，相对于化疗前，T效应基因CD8A和IRF-1在化疗后肿瘤中表现出显著更高的表达水平（图5c）。GSE71340 的新辅助治疗前或新辅助治疗后的非配对 HGSOC 肿瘤也观察到类似的结果 。接受新辅助治疗的 HGSOC 肿瘤显示免疫亚群显著富集，尤其是效应细胞，如活化的 CD8+ T 细胞、NK T 细胞和活化的 B 细胞（图 5d）。本研究还发现化疗敏感的 HGSOC 肿瘤与化疗耐药肿瘤相比，其特点是浸润免疫效应细胞显著富集（图 5e）。此外，与化疗耐药肿瘤相比，化疗敏感肿瘤的细胞溶解活性显著更高（图 5f）。这些结果表明化疗参与调节免疫微环境和刺激免疫效应细胞的瘤内浸润，这两者都与化疗敏感性相关。

图 5

04、HGSOC肿瘤免疫表型和分子亚型之间的相互作用

本研究首先根据 28 个免疫亚群的浸润水平对 HGSOC 肿瘤进行聚类，并投影到二维 UMAP。UMAP中亚型的分布（图6a）表明分子亚型具有不同的免疫表型。UMAP1 维度与免疫浸润相关，间充质和免疫反应性分子亚型往往通过 UMAP2 维度来区分。尽管与增殖和分化亚型相比，间充质和免疫反应性分子亚型都显示出更高水平的TIL，但间充质和免疫反应性分子亚型之间的TIL组成仍然存在差异（图6b）。例如，间充质分子亚型和免疫反应性分子亚型之间的 M1 巨噬细胞浸润存在显著差异，但 M2 巨噬细胞没有差异。这些观察结果强调了 HGSOC 肿瘤 TME 中免疫浸润细胞组成的异质性。  

05、基于活化CD8+T和调节性T细胞组合的免疫亚型细化  

众所周知，活化的 CD8 T 细胞在抗肿瘤免疫反应中发挥着关键作用，而调节性 T 细胞 (Treg) 能够针对 CD8+ T 细胞介导的抗肿瘤免疫反应形成免疫屏障 。然而，在 TME 中观察到激活的 CD8 T 细胞和 Tregs 之间存在显著的正相关性（图 6c）。因此，本研究进一步研究了活化的 CD8 T 细胞和 Tregs 之间的串扰是否可能涉及临床不同的行为。本研究将高和低活化 CD8 T 浸润定义为高于和低于中位密度的值，并根据中位值类似地定义高和低 Treg 水平，并发现活化 CD8 T 和 Tregs 的组合可以产生 HGSOC 的四种不同免疫学亚型。如图6c所示，免疫组I的特点是活化的CD8 T细胞和Tregs（称为CD8low/Tregslow）的低浸润，而免疫组III的特点是活化的CD8 T细胞和Tregs的强烈活化（称为 CD8high/Tregshigh）。免疫组II的特点是高水平的活化CD8 T细胞浸润和低水平的Treg细胞浸润（简称CD8high/Tregslow），免疫组IV的特点是高水平的Treg细胞浸润和低水平的活化CD8 T细胞浸润（简称CD8low/Tregshigh）（图 6c）。通过检查四种免疫组和四种现有分子亚型之间的关联强度，本研究发现间充质亚型富含CD8low/Tregshigh亚型，而免疫反应亚型富含CD8high/Tregslow和CD8high/Tregshigh亚型。CD8low/Tregslow亚型在增殖亚型中具有最高的代表性，并且在四种免疫学亚型中没有观察到分化亚型的明显不同分布（图6c）。本研究还评估了四种免疫亚型患者的生存率，如图6d所示，CD8high/Tregslow亚型的患者表现出最长的生存时间，而CD8low/Tregshigh亚型的患者总生存期最差。尽管 CD8low/Tregslow 和 CD8high/Tregshigh 之间的 TIL 存在显著差异，但两组之间的总生存率没有显著差异。

图 6

小编总结

本研究分析了495个TCGA HGSOC肿瘤的多组学数据和1708个HGSOC肿瘤的RNA-seq数据。多因素 Cox 回归分析和荟萃分析用于识别预后基因。使用 ssGSEA 方法对 28 种免疫细胞类型的免疫微环境进行了表征。对 14 名患者的肿瘤组织进行免疫组织化学染色，进一步验证了主要发现。共有 1142 个基因被鉴定为有利的预后基因，这些基因普遍存在于免疫相关通路中，并且观察到大多数免疫亚群的浸润与良好的预后相关，这表明肿瘤免疫原性是与改善预后相关的最显著因素。 本研究确定了免疫原性的多个基因组和转录组决定因素，包括 4q 染色体的拷贝丢失和同源重组通路的缺陷。最后，以活化 CD8 T 细胞浸润增加和 Tregs 减少为特征的免疫亚型与良好的预后和改善的治疗效果相关。

这项研究有一些应该承认的局限性。首先，考虑到测量技术和瘤内异质性的局限性，本研究在生物标志物的发现阶段选择了宽松的FDR，而更严格的FDR则有局限性，并且可能存在偏差。其次，之前发表的文献中对 OS 的定义并没有以同样的方式使用。第三，HGSOC的标准并未经过病理学、免疫组织化学或突变/基因表达状态验证，而是来自先前发表的文献，但并不总是一致。因此，为了保持不同数据集之间的一致性并包含尽可能多的样本，本研究将HGSOC定义为同时具有高级别（≥2）和高阶段（≥III）的肿瘤。第四是研究的回顾性。尽管回顾性研究试图纳入尽可能多的患者队列以进行更严格的发现，但生物标志物和免疫学分类需要在遵循 REMARK 标准的独立精心设计的临床试验中进行前瞻性验证。