科研丨浙商大: 微塑料和金霉素对番鸭肠道屏障、肠道菌群和抗生素耐药基因组的联合影响(国人佳作)

编译：微科盟阿曼，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读   抗生素和微塑料(MPs)因其数量的不断增加和对生态系统的生态风险，已成为全球关注的焦点。然而，MPs暴露如何影响水禽体内抗生素的生物积累和风险仍知之甚少。本研究将番鸭(Cairina moschata)暴露于聚苯乙烯微塑料和金霉素(CTC)的单一和联合污染中，持续暴露56天，研究MPs对CTC在鸭肠道中生物积累的影响及其风险。MPs暴露降低了鸭肠道和肝脏中CTC的生物积累，并增加了鸭粪便中CTC的排泄。MPs暴露导致严重的氧化应激、炎症反应和肠道屏障损伤。微生物组分析显示，MPs暴露通过增加链球菌属(Streptococcus)和螺杆菌属(Helicobacter)的丰度引起微生物群失调，这可能会加剧肠道损伤。MPs和CTC联合暴露通过调节肠道微生物组减轻肠道损伤。宏基因组测序显示，MPs和CTC联合暴露增加了肠道微生物群中普雷沃氏菌属(Prevotella)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和巨单胞菌属(Megamonas)的丰度以及总抗生素抗性基因(ARGs)的发生率，特别是四环素ARGs亚型。本研究结果为水生环境中聚苯乙烯微塑料和抗生素对水禽的潜在风险提供了新的见解。  

图文摘要

论文ID

原名：Combined effects of microplastics and chlortetracycline on the intestinal barrier, gut microbiota, and antibiotic resistomeof Muscovy ducks (Cairina moschata)

译名：微塑料和金霉素对番鸭肠道屏障、肠道菌群和抗生素耐药基因组的联合影响

期刊：Science of The Total Environment

IF：9.8

发表时间：2023.5

通讯作者：惠彩

通讯作者单位：浙江工商大学环境科学与工程学院

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2023.164050

实验设计

结果与讨论

1MPs和CTC暴露对番鸭生长性能的影响 

大量实验证据表明，MPs会降低动物的体重，如水生生物和小鼠。然而，关于MPs对水禽健康风险的数据非常有限。在本研究中，番鸭暴露在MPs中8周。暴露期间每周监测采食量和体重。单独暴露于CTC、单独暴露于MPs或同时暴露于CTC和MPs 8周后，与CK和CTC组相比，所有MP处理组(MP和CM)的最终体重和平均日增重均显著降低(P<0.05)，而饲料转化率显著提高(P<0.05)(图1A-B和表S2)。具体而言，暴露于MPs五周后，番鸭体重开始显著下降(P=0.041)(图1C)。这些结果与之前对幼鱼或小鼠的研究结果一致。这可能是因为摄入的MPs阻塞了消化道，引起饱腹感或吸收不良，导致采食量和饲料转化率降低。虽然MPs暴露不会对生长性能产生不良影响，但MPs的类型、直径、浓度和暴露时间的差异可能解释了不同研究之间的差异。

抗生素曾被用于改善家禽的生长性能和提高饲料利用率。本研究再次验证了CTC对肉鸭生长性能的改善，与CK相比，饲粮中添加CTC显著提高了番鸭的体重(P<0.05)，并显著降低了饲料转化率(P<0.05)(图1A-B和表S2)。这些结果与之前对鸭和猪的研究结果一致，CTC提高了这些动物的免疫水平，改善了肠道健康，从而提高了它们的生长性能。与MP组相比，暴露于MPs和CTC 6周后，番鸭的体重增加(P<0.05)(图1C)。可能的解释是，CTC在一定程度上提高了免疫水平并减轻了胃肠道损伤，下文将对此进行讨论。

图1. CTC和MPs联合暴露对番鸭生长性能的影响。(A-B)分别为各组番鸭的最终体重和饲料转化率；(C)为暴露于MPs和CTC 8周的番鸭体重的周动态变化。所有数据均以平均值±SD表示(n=6)，不同字母(a-d)表示差异有统计学意义(P<0.05)。       

2 金霉素和MPs在组织和粪便中的生物累积

众所周知，抗生素的使用可能导致动物组织和产品(牛奶、鸡蛋和肉类等)中抗生素残留。在本研究中，不含CTC饲料喂养的鸭的组织和粪便中未检测到CTC(图2)。与CK和MP组相比，饲粮中添加CTC显著增加了其在鸭的肝脏、肾脏、空肠和胸肌中的生物累积量，且单独暴露于CTC的鸭的CTC生物累积量最高。这些结果与小鼠和斑马鱼的研究结果一致。由于MPs表面积大，可以吸收和转运其他污染物，从而影响这些污染物在生物体中的积累效应。最近的一项研究报道称，MPs促进了暴露于5 μm原始微塑料的鲫鱼肠道中ROX的积累。然而，在本研究中，MPs显著降低了CTC在番鸭组织中的生物累积，这与一项研究结果一致，即暴露于MPs的小鼠组织中磺胺甲恶唑的生物累积减少。考虑到MPs可以吸附CTC，游离CTC浓度的降低可能是CM处理中CTC生物积累减少的原因。此外，MPs直径的差异决定了MPs是否能被肠道吸收，这可能解释了这些结果之间的差异。作者在MP和CM处理番鸭的血清和肠道消化液中观察到少量直径较小的MPs(图S1)，说明直径较小的MPs可以进入鸭的血液和肠道并积累。然而，并不是所有的MPs都能被肠道吸收，导致被MPs吸附的CTC的排泄。相应地，同时暴露于CTC和MPs的鸭子粪便中CTC的排泄量增加(图2)。需要进一步研究MP粒径对各种生物体内抗生素生物积累的影响。

图2. CTC和MPs联合暴露对番鸭小肠、肝脏、肾脏、胸肌和粪便中金霉素含量(ng/g ww)的影响。所有数据均以平均值±SD表示(n=6)，不同字母(a-d)表示差异有统计学意义(P<0.05)。     

3 MPs和CTC暴露对番鸭肠道组织病理学和屏障的影响 

肠黏膜上皮和肠道相关淋巴组织是肠道屏障的主要组成部分，其结构完整性在一定程度上反映了肠道的健康状况。MPs优先与脂质膜相互作用并引发肠道通透性的改变。H&E染色显示MP和CM处理对番鸭空肠的组织病理学损伤。如图3A所示，CK和CTC组外观正常，具有规则、完整、紧密排列的肠绒毛、隐窝结构、肠黏膜结构，而MP处理组(MP和CM)肠绒毛、隐窝结构均被破坏，主要表现为以下特征：绒毛变短且排列不规则，肠上皮细胞溶解脱落(黄色箭头)，粘膜固有层炎性细胞浸润(蓝色箭头)。此外，MP和CM处理后肠壁厚度(暗箭头)显著增加。 为了进一步了解MP和CM处理对空肠黏膜物理屏障功能的影响，采用ELISA检测了血清二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸(D-LA)含量。图3B-C显示，与CK和CTC组相比，MPs暴露显著增加了血清中D-LA含量和DAO活性(P<0.05)。免疫印迹分析证实了这些结果，尽管紧密连接蛋白(如Occludin和ZO-1)在空肠中的表达下调表明紧密连接的破坏导致肠道通透性增加。如图3D-E所示，与CK和CTC组相比，MP处理组Occludin蛋白和ZO-1的表达下调。同样，暴露于聚苯乙烯微塑料(2 μm)或纳米塑料(80 nm)两周后会导致河蚬的严重上皮损伤。在斑马鱼中，暴露于1000 μg/mL MPs (70 μm)中10天会引起肠道损伤，如绒毛裂纹和肠细胞分裂。粘液可以影响上皮细胞和细菌之间的粘附，从而作为一个重要的保护屏障。粘液的消耗会导致细菌易位增加。从图3F-G可以看出，空肠AB-PAS染色显示，所有MP处理组的粘液分泌均被抑制，说明肠道微生物的生境发生了改变。这种现象可能是由于特定的细菌聚集削弱了肠道屏障的完整性。上述结果证实，暴露于MPs会对空肠组织造成严重损伤，影响鸭子对营养物质的消化和吸收，从而导致生长性能下降。

先前的一项研究表明，CTC的应用有助于改善断奶仔猪的肠道损伤。同样，本研究中MPs诱导的肠道通透性和屏障损伤程度较CM减轻，这主要表现在血清DAO活性和D-LA水平上。这些结果表明，MP与CTC联合暴露减轻了MPs引起的肠道损伤，进一步证实了CTC暴露减少体重减轻与肠道健康改善有关。然而，在鲫鱼中进行的一项研究发现，MPs和罗红霉素联合暴露会造成更严重的组织病理学损伤。另一项研究报道称，MPs和土霉素联合暴露可减轻土霉素对斑马鱼肠道的损伤。实验对象、MPs和抗生素类型的差异可能解释了这些结果之间的差异，抗生素和MPs对肠道健康的确切相互作用值得进一步研究。

图3. CTC和MPs联合暴露对番鸭肠道组织病理学和屏障功能的影响。图(A)为空肠H&E (40x)染色的代表图；(B-C)为血清中DAO活性和D-LA含量；图(D-E)为空肠组织Occludin和ZO-1蛋白的免疫印迹分析(n=3)；图(F)为空肠AB-PAS (100×)染色的代表图；图(G)为每100 μm绒毛杯状细胞(绿箭头)的数量。所有数据均以平均值±SD表示(n=6，除非另有说明)，不同字母(a-c)表示差异有统计学意义(P<0.05)。

4 MPs和CTC暴露对番鸭肠道氧化应激反应的影响

机体的抗氧化功能对于保持肠道屏障完整性和预防病原体感染至关重要。大量证据表明，MPs可诱导ROS生成和抗氧化能力失衡，从而导致严重的氧化损伤。对鲤鱼和欧洲鲈鱼(D. labrax)的研究发现，长期暴露于MPs会降低肠道和肝脏中CAT、T-SOD和GSH-Px的活性。本研究证实了MP诱导的鸭小肠氧化损伤的发生，MPs暴露8周后ROS生成和MDA含量显著增加(P<0.05)，T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，空肠黏膜GSH含量降低(图4)。相反，其他研究报道急性暴露于MPs后，斑马鱼和鲫鱼肝脏中CAT和T-SOD活性增强。MP暴露时间的差异可以解释这些结果之间的差异。急性MP暴露可导致抗氧化酶活性迅速增加，以清除ROS作为解毒机制，而长期MP暴露可导致ROS持续积累，破坏抗氧化平衡，导致抗氧化酶活性丧失。MP组和CM组氧化应激生物标志物无显著差异(P>0.05)，表明CTC和MPs共暴露对肠道氧化应激无交互作用。虽然在胸肌中未检测到MPs残留，但CTC和MPs暴露对肉质产生不利影响，表现为经MP和CM处理的鸭胸肌滴水损失增加(表S3)。胸肌系水力下降可能与CTC和MPs暴露引起的氧化应激有关。最近的一项研究也报告了MPs暴露会降低鸡肉品质。

图4. CTC和MPs联合暴露对番鸭空肠氧化应激生物标志物的影响。所有数据均以平均值±SD表示(n=6)，不同字母(a-c)表示差异有统计学意义(P<0.05)。       5 MPs和CTC暴露对鸭肠道炎症反应的影响  

由于炎症因子的表达，MP暴露引起的肠道损伤直接影响免疫系统。越来越多的证据表明，MPs在肠道内的摄入和积累可引起动物的机体阻塞和炎症反应。Qiao等人发现MPs积累会引起肠道炎症，其特征是斑马鱼体内IL-1α水平显著升高。Liu等人报道MP暴露会增加小鼠炎症因子(TNF-α、IL-1β和IFN-γ)的表达。本研究结果与上述研究结果一致，与CK和CTC组相比，MPs暴露导致空肠粘膜IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.05)，空肠IL-10水平降低(图5)。MPs暴露可诱导或加剧炎症反应，这可能归因于MPs触发ROS生成和氧化应激，这在本研究中得到了验证。

图5. CTC和MPs联合暴露对番鸭肠道炎症因子水平的影响。所有数据均以平均值±SD表示(n=6)，不同字母(a-b)表示差异有统计学意义(P<0.05)。

6 MPs和CTC暴露对鸭肠道菌群多样性的影响   

MPs诱导的胃肠道健康与肠道菌群失调密切相关。采用宏基因组测序技术研究了MPs和CTC对鸭肠道微生物组的联合影响。鸟枪法测序，共获得211766个reads。数据预处理后，获得9964-11221个clean reads，其中>Q20的高质量reads超过95.97%，>Q30的高质量reads超过>89.92%。高质量reads被组装成平均长度在1248.28-1811.77 bp的scaftigs。数据处理和序列组装的统计结果如表S4所示。根据分类注释信息，85.84%-90.06%的基因为细菌，而古菌(0.1-1.9%)、病毒(0.10-0.13%)和真核生物(0.01-0.03%)的丰度较低。因此，下面的分析主要集中在细菌上。

采用α多样性值评估肠道菌群的丰富度(Chao1和Observed species)和多样性(Shannon指数和Simpson指数)。如图6A-C所示，与CK相比，CTC暴露降低了Observed species、Chao1和Shannon指数，表明CTC暴露后细菌丰富度和多样性下降。这些结果与一项研究结果相吻合，该研究表明，经CTC处理的猪结肠内容物中的α多样性降低。此外，CTC和MPs联合暴露恢复了细菌多样性，表现为Observed species和Shannon指数增加。这些变化可能是由于抗生素被MPs吸附所致。4个处理组间Simpson指数无显著差异(P>0.05，图6D)。采用非度量多维标度(NMDS)分析(图6E)和UPGMA聚类分析(图6F)来可视化微生物群落的变化。如图6E-F所示，同一处理组的样本聚集在一起，并与其他处理(CK.2除外)分开。据报道，在单独或联合暴露于抗生素和MPs下，鲫鱼、斑马鱼(Danio rerio)和小鼠肠道微生物群的细菌群落结构发生了显著变化。这些结果表明，单独或联合暴露于CTC或MPs对肠道细菌群落结构有不同的影响。

图6. CTC和MPs联合暴露对番鸭盲肠微生物多样性的影响。图(A-D)分别为Observed species、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数；图(E)为非度量多维标度(NMDS)分析图，显示微生物群落在属水平上的变化；图(F)为基于Bray-Curtis距离的门水平微生物群落相似性UPGMA聚类树。       

7 MPs和CTC暴露对鸭肠道微生物组成的影响   

在CTC和MPs处理的鸭子中，门和属水平的肠道微生物群相对丰度发生了变化(图7A-B)。如图7A所示，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、Chordata、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是所有样本中数量最多的门，这与在鸭上的研究结果一致。CTC暴露使拟杆菌门丰度从27.94%增加到69.30%，厚壁菌门丰度从46.19%减少到22.10%。拟杆菌门丰度的增加可能是由于它们对CTC具有较强的抗性，因为一些物种有利于CTC的生物降解。这些结果与先前的研究结果高度一致。上述菌门的变化也可以解释CTC处理的番鸭的饲料转化率的提高，因为一些拟杆菌具有促进复合多糖消耗和短链脂肪酸生成的酶。MPs暴露增加了变形菌门的丰度(MP：4.25%，CK：2.86%)。在评估MPs对小鼠和斑马鱼肠道微生物组的影响时，也观察到变形菌门丰度的显著增加。一般来说，大多数变形菌被认为是致病菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，变形菌门丰度的增加代表肠道生态失调。此外，变形菌门丰度的增加与肠道炎症的严重程度呈正相关。

综上所述，MP处理引起的严重肠道损伤可能与门水平上变形菌门丰度的增加有关。 在属水平上，拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、Phocaeicola、梭菌属(Clostridium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、真杆菌属(Eubacterium)、另枝菌属(Alistipes)和粪杆菌属(Faecalibacterium)为优势菌属(图7B和图S2)。与对照相比，CTC处理后，拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Phocaeicola和另枝菌属的丰度显著增加。对照组普雷沃氏菌属、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、链球菌属和螺杆菌属(Helicobacter)的相对丰度分别占3.86%、0.34%、0.17%和0.39%，经MPs处理后分别增加到7.60%、2.76%、1.48%和1.31%。此外，抗炎菌属Clostridium和Faecalibacterium的丰度在MPs处理后显著降低，分别从3.94%和2.29%降至2.15%和1.23%。在CTC和MPs联合暴露后，普雷沃氏菌属、粪杆菌属和巨单胞菌属(Megamonas)的丰度显著增加。

研究结果表明，单独或联合暴露于CTC或MPs对肠道微生物组成有不同的影响。 为了进一步分析与MPs和CTC暴露引起的肠道损伤相关的肠道微生物群，通过MetaStat和LEfSe分析确定了MPs和CTC处理组之间的显著差异属。如图7C-D所示，在4组中共鉴定出40个LDA评分>4的生物标志物，主要属于厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。CK组Eubacterium、Blautia、Clostridia bacterium、Candidatus Eubacterium faecigallinarum的丰度较高。CTC处理的优势菌群为拟杆菌属和Phocaeicola，以及Phocaeicola coprocola和Caecibacteroides pullorum。拟杆菌属和Phocaeicola都被认为是健康微生物组的重要成员，可以在肠道中产生短链脂肪酸，从而增强粘膜免疫力。链球菌属和螺杆菌属在MP处理组鸭肠道中富集。链球菌属是肠道中的条件致病菌，通过发酵碳水化合物或淀粉产生短链脂肪酸。在宿主免疫力较弱的情况下，链球菌的扩增导致感染，并通过调节免疫细胞在炎症性肠病的发展中发挥着关键作用。螺杆菌属的某些特定物种(即H. pullorum和H. pylori)可以分解肠道粘蛋白的寡聚结构，从而使病原体能够在黏液层中自由移动，诱发肠道炎症。

因此，MP处理鸭的肠道中链球菌属和螺杆菌属的变化可能与严重的肠道氧化和炎症损伤有关。普雷沃氏菌属、巨单胞菌属和Prevotella copri在CM组鸭肠道中富集。抗炎菌巨单胞菌属(Megamonas)是丙酸的主要产生菌之一，它可以编码与丙酸盐和蜜二糖代谢相关的酶来抑制病原体。普雷沃氏菌属的特定物种可以对免疫系统产生积极影响，具有抗炎特性，通过诱导Tregs和调节细胞因子来缓解炎症性肠病。综上所述，MPs对肠道损伤的缓解可能归因于CTC对抗炎普雷沃氏菌和巨单胞菌属的相对丰度的调节。 为了确定肠道微生物群的变化与肠道氧化应激和炎症生物标志物之间的潜在关联，以及它们与肠道屏障和通透性的密切联系，对前25个丰度最高的属与肠道氧化应激和炎症生物标志物进行了Pearson相关分析。肠道微生物群可以通过粘膜细胞直接或间接地促进ROS的生成。

在本研究中，链球菌属和螺杆菌属与空肠ROS生成呈正相关(图7E)，这与先前的研究结果一致，即链球菌属和螺杆菌属(如幽门螺杆菌和Streptococcus agalactiae)的物种可以通过激活巨噬细胞触发中性粒细胞产生ROS，并增强一氧化氮和一氧化二氮的产生。粪杆菌属是家禽盲肠中的主要产丁酸菌，具有抗炎和抗氧化特性。双歧杆菌(Bifidobacterium)是产乙酸和丁酸的菌，具有良好的抗氧化活性，可以抵御ROS引起的氧化应激。对肉鸡和猪的研究也报道了盲肠中粪杆菌属和双歧杆菌属的丰度与T-AOC活性呈正相关。这些结果与本研究的结果一致，即Faecalibacterium和Bifidobacterium可能是宿主抗氧化能力的阳性指标，因为它们与T-AOC活性或GSH含量降低呈正相关。然而，Prevotellaceae_UCG_001丰度的增加与妊娠母猪的抗氧化活性降低有关，这与本研究结果一致。 

考虑到炎症细胞因子和微生物组成的变化，促炎IL-β浓度的变化与norank_f_Oscillospirace、螺杆菌属、norank_f_norank_o_RF39和Mucispriiium的丰度呈显著正相关。TNF-α含量与norank_f_Oscillospirace和Mucispriiium的丰度呈正相关。Oscillospiraceae是一种与炎症相关的条件致病菌，参与粘液蛋白的蛋白骨架降解，促进肠道屏障损伤，并引发全身性炎症反应。Mucispirillum也被认为是一种可能加剧炎症的条件致病菌，其增加可能会导致粘蛋白降解并与肠道炎症相关。抗炎IL-10水平与链球菌属、norank_f_Oscillospiraceae和Rikenllaceae_RC9_gut_group的丰度呈负相关，但与盲肠内容物中脱硫弧菌属的丰度呈正相关。脱硫弧菌是一种条件致病菌，可产生硫化氢，损伤肠道上皮细胞并增加肠道通透性。

血清DAO活性和D-LA含量是肠道屏障功能完整性的标志，因为肠道屏障功能发育不全会导致其释放到循环血液中。DAO活性和D-LA含量的变化与norank_f_Oscillospirace、链球菌属和螺杆菌属的丰度呈正相关，而D-LA含量与拟杆菌属和粪杆菌属丰度呈负相关。这些结果表明，肠道微生物菌群紊乱在增加肠黏膜屏障的通透性方面起着重要作用。综上所述，相关性分析进一步揭示了盲肠微生物组与肠道氧化应激和炎症损伤之间的潜在联系，并表明肠道微生物组可能直接或间接影响肠道屏障和通透性。

图7. CTC和MPs联合暴露对番鸭盲肠微生物组成的影响。图(A、B)分别为门和属水平的微生物群组成；图(C、D)为线性判别分析效应量(LEfSe)结果，LDA>4.0，P<0.05；图(E)为属水平(top 25)肠道微生物群与肠道抗氧化指标、炎症细胞因子和肠道通透性生物标志物的Spearman相关性热图。颜色的强度表示关联程度(红色，负相关；蓝色，正相关)。显著相关关系用*P<0.05和**P<0.01表示。       

8 MPs和CTC暴露对鸭肠道耐药基因组的影响   

ARGs和MPs是近年来备受关注的两种重要的新兴污染物。有关抗生素和MPs联合暴露对肠道耐药基因组的影响已在鱼类和小鼠中进行研究。然而，需要进一步研究其他生物以更好地评估这两种污染物的生态风险。本研究通过宏基因组分析揭示了MPs和CTC联合暴露对番鸭肠道耐药基因组的影响。在番鸭肠道中共检出21类697种ARGs。与CK、MPs或CTC单独暴露相比，MPs和CTC联合暴露显著增加了肠道微生物群中ARGs的总丰度(图S3)。在磺胺甲恶唑和MPs联合处理的小鼠肠道中也检测到总ARGs丰度显著升高。这可以通过MPs经常充当抗生素和ARGs的携带者这一事实来解释。PCA分析显示，MP暴露没有显著改变ARG模式，而CTC暴露则有一定影响。

然而，CM样本(同时暴露于MP和CTC)比CTC样本更接近CK和MP样本(图8A)。这些结果表明，尽管联合暴露处理增加了ARG丰度，但它削弱了CTC对ARG谱的影响。 Venn图显示，所有样本共享585个ARGs，占所有检测到的ARG亚型的83.9%。同时，CK、MP、CTC和CM样品中分别有6、4、5和3个ARGs(图8B)。与CTC样本相比，CM样本中独有的ARGs较少，这支持了PCA结果，即MPs和CTC联合暴露减少了ARG谱的变化。Yu等人也报道了MPs和土霉素的联合暴露可以减弱MP单独暴露引起的差异。此外，多药耐药基因是所有样品中主要的ARGs，其在每个样品中的相对丰度占所有ARGs的29-34%，其次是MLS(17-19%)、糖肽类(13-14%)、多肽类(8.5-11%)和四环素类(9-10%)。

其中，CTC样本中多药耐药基因和MLS耐药基因的丰度最高(图8C)。解释为何在CTC处理的样本(CTC和CM)中未检测到四环素耐药基因丰度最高是很重要的。可能的原因是：(1)对照样本(CK)中其他ARG类型(即多药耐药型、MLS型和糖肽型)的相对丰度较高；(2)同一微生物可能携带不同类型的ARG，而四环素耐药基因的富集可能伴随着其他类型的ARG。 从ARG亚型来看，macB、bcrA、tetA(58)、msbA、tetQ是含量最高的5种ARG，分别对大环内酯类、多肽类、多药耐药和四环素类抗生素耐药(图8D)。tetA(58)、tetQ、tetT、tetB(P)和tetA(46)是所有样本中主要的四环素耐药基因(图8E)，MPs暴露降低了tetA(46)、tetB(60)和tet(43)的丰度，而CTC暴露显著增加了tetQ和tet37的丰度。

相比之下，CTC和MPs联合暴露显著增加了四环素ARG亚型的丰度(P<0.05)，包括tet(35)、tet36、tet37、tet38、tetA(60)、tetB(46)、tetW、tetS和otr(B)(图8E和图S4)，表明抗生素和MPs对ARG谱存在协同作用，这与P. Zhang等人的研究结果一致。 细菌群落组成是土壤中ARG分布的主要决定因素，因此细菌群落的变化会影响ARGs的丰度。图9A显示了鸭肠中top10的细菌属与前5个ARG类别(多药耐药、MLS、糖肽类、四环素类、多肽类)之间的关系。在所有样本中，拟杆菌属、Phocaeicola、普雷沃氏菌属、副拟杆菌属、真杆菌属和梭菌属对主要ARGs贡献均较高。所有这些菌属都属于拟杆菌门和厚壁菌门，它们被报道为多种ARGs的潜在宿主。CTC处理显著提高了拟杆菌属和Phocaeicola的贡献率，而CTC和MPs联合处理显著提高了普雷沃氏菌属的贡献率。然而，与未处理的对照组相比，处理组特别是CTC暴露组(CTC和CM)显著降低了真杆菌属的贡献。结合图7C-D所示的差异富集菌株，CTC和MP单独或联合暴露通过改变肠道微生物群落结构改变了ARG谱，这与其他研究一致。还进行了方差分解分析(VPA)和冗余分析(RDA)(图S5)来评估CTC和MPs对细菌群落和ARGs的贡献。MPs暴露对肠道微生物群和抗生素耐药基因组的直接影响不大，但它们改变了肠道通透性、抗氧化和炎症参数(图3、图4、图5)，从而影响了肠道微生物群和抗生素耐药基因组。

如图S5所示，肠道通透性、抗氧化、炎症参数和CTC浓度对肠道细菌群落变化的贡献率高达80%(图S5A)，而这些参数仅解释了耐药基因组变异的28.8%(图S5B)。这可以解释为细菌群落结构和可移动遗传元件对ARGs分布的贡献更大。 由于ARGs与微生物类群的共现模式可以指示可能的ARG宿主，因此对前50个属和前20个ARG亚型进行共现网络分析，以预测鸭肠中ARGs可能的宿主。如图9B所示，ARG类型以多药耐药基因(10/20)、MLS耐药基因(2/20)和四环素耐药基因(2/20)为主，潜在宿主主要为拟杆菌门和厚壁菌门。这一结果证实了ARG贡献分析的结果(图9A)。

具体而言，拟杆菌属与6种多药耐药ARG亚型、1种MLS、四环素和糖肽ARG亚型具有显著相关性(P<0.05)。拟杆菌存在于正常人类肠道菌群并且是条件致病菌。临床中心检测到许多耐多药拟杆菌。Paraprevotella与6种多药耐药ARG亚型显著相关(P<0.05)。Gemmiger与5个ARG类别中的8个ARG亚型具有很强的相关性。毛螺菌科(Lachnospiraceae)与6个ARG类别中的7个ARG亚型具有较强的相关性。Oscillospiraceae与4个多药耐药ARG亚型(arl、efrA、msbA和baeS)呈显著正相关。此外，tetQ和tetA(58)与Oscillospiraceae、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Agathobaculum、Paraprevotella、Flavonifractor、Mediterranea、Intestinimonas和未分类拟杆菌目具有很强的相关性(r>0.7)，表明这些属是tetQ和tetA(58)基因的潜在宿主。macB和oleC与Oscillospiraceae、Agathobaculum、Paraprevotella、Gemmiger和未分类拟杆菌目显著相关(r>0.7)。这些结果揭示了ARG主要亚型的潜在宿主。

综上所述，本研究结果为水生环境中聚苯乙烯MPs和抗生素对水禽的潜在风险提供了新的见解。聚苯乙烯MPs与抗生素联合暴露引起肠道微环境的改变，可能改变抗生素耐药基因组并促进ARGs在水生生态系统中扩增和传播，可能威胁健康。因此，建议在集约化养鸭场尽量减少塑料制品和抗生素的使用，并对鸭的饮用水进行净化以去除MPs，从而降低MPs暴露的潜在风险。

图8. CTC和MPs联合暴露对肠道微生物群中抗生素耐药基因(ARG)丰度模式的影响。图(A)为基于Bray-Curtis距离的PCA图，显示了不同处理下ARGs的分布模式；图(B)为维恩图，显示不同处理间共享和独有的ARGs数量；图(C)为Circos图，显示了不同样本中前15个ARO类别的相对丰度；图(D)为Circos图，显示了不同样本中前25个ARO的相对丰度；图(E)为不同样本中四环素ARGs亚型的相对丰度；图(F)为基于Kruskal-Wallis H检验的四环素ARGs亚型的差异分析条形图。

图9. 共现网络分析说明了ARGs与肠道微生物群之间的相关性。 图(A)为前10个菌属和前5个ARGs的贡献分析； 图(B)为所有样本中ARGs及其潜在宿主菌基于spearman相关分析的共现网络分析。 Spearman相关系数 r >0.6， P <0.05。

结论

微塑料(MPs)和抗生素因其对生态系统的风险日益增加而备受关注。然而，关于MPs如何影响抗生素的行为和作用及其对水禽的潜在风险的信息有限。在本研究中，MPs暴露减少了鸭组织中金霉素(CTC)的生物积累，并引起严重的肠道炎症和氧化损伤，以及肠道微生物群失调。链球菌属、螺杆菌属和norank_f_Oscillospirace丰度的改变可能会影响肠道通透性，从而损害肠道屏障并刺激肠道炎症。MPs和CTC联合暴露可以通过降低肠道炎症反应和调节肠道微生物组显著减轻MPs引起的肠道损伤。值得注意的是，不同的暴露处理改变了肠道细菌群落结构，从而改变了ARG谱。MPs和CTC联合暴露显著增加了肠道微生物群中ARGs的丰度，尤其是四环素ARG亚型，但削弱了CTC对ARG谱的影响。共现网络分析表明，潜在的ARG宿主主要属于拟杆菌门和厚壁菌门。这些结果有助于更好地了解MPs与共存抗生素之间的相互作用及其对水禽生态毒理学和生态系统内ARGs转移的综合影响。