纳米抗体穿过BBB的方式
前言
穿过血脑屏障的给药方法通常是静脉注射或鞘内注射。这两种方法各有优缺点。静脉注射后药物通过血脑屏障递送的特点是组织损伤低,但通常靶器官中的药物浓度也较低。而鞘内注射会提高大脑中药物浓度,但有更大的组织损伤风险。目前,微创甚至无创的诊断和治疗方法最受关注。如何减少药物给药的危害,使其有效地通过血脑屏障是研究的重点之一。与普通抗体相比,Nb的大小仅为其1/10,因此在理论上Nb应该有更好的机会穿透血脑屏障,这可能为无创或微创治疗提供优势。
血脑屏障BBB
人体内的屏障结构有血睾酮屏障、血眼屏障、血胎盘屏障等。其中,保护中枢神经系统(CNS)的血脑屏障是人体内最难通过的屏障结构。血脑屏障功能的产生和维持主要取决于脑微血管内皮细胞(BMEC)与星形胶质细胞和内皮细胞之间的相互作用。这些结构、毛细血管基膜、小胶质细胞和神经元统称为神经血管单元(图1)。
穿过血脑屏障的自然方式
血脑屏障允许分子以多种方式通过。第一种方式是被动扩散。脂溶性和分子量决定了被动扩散的效率。当分子量大于400Da时,脂溶性不会增加其穿透血脑屏障的效率。同时,极性表面积(PSA)大于80 Å2并且倾向于形成6个以上氢键也被认为是化合物进入中枢神经系统的限制因素。第二种途径是主动外排。ATP结合盒蛋白(ABC蛋白)在血脑屏障的皮质内膜中表达。它们通过外来分子和内源性代谢物的主动外排导致中枢神经系统的耐药性特征。第三种途径是通过特定载体蛋白的载体介导转运(CMT)。氨基酸、脂肪酸和其他物质以这种方式穿过血脑屏障。第四种途径是胞吞作用,包括受体介导的胞吞作用(RMT),其中较大分子通过与特定受体结合启动胞吞作用;以及吸附选择性介导的胞吞作用(AMT),其基于正电荷吸附到细胞膜中的特定位点。
图1 神经血管单位的结构和纳米抗体血脑屏障递送的方法 [1]
纳米抗体穿过血脑屏障的常见方式
Nb使用与上述类似的生理机制穿过血脑屏障(图1)。因此在大脑中获得的Nb的浓度不仅取决于Nb穿过血脑屏障的能力,还取决于其药代动力学特征。使用多价Nb以增加其亲和力,或使用血清半衰期延长的Nb显示出亲和力和循环时间影响脑中Nb的摄取。
通过受体介导的胞吞作用(RMT)递送Nbs
被公认的可介导Nbs转胞吞作用的膜受体包括α(2,3)-唾液酸糖蛋白受体(α(2,3)-SGPR);胰岛素样生长因子1受体(IGF1R);血管细胞黏附分子1(VCAM-1);朊病毒蛋白(PrPs);转铁蛋白受体1(TfR1)。
首先被研究发现通过RMT穿过血脑屏障的Nb是FC5和FC44[2]。C5与BMECs(脑微血管内皮细胞)的a(2, 3)-唾液酸糖蛋白受体结合,从而触发包膜介导的内吞作用。将FC5 Nb与人Fc段融合,可以改善血清药代动力学,并增强化学偶联剂的药理作用。FC5与Fc的双价融合在穿越脑上皮细胞单层方面,与单价融合相比,显示出显著增加的胞吞速率。靶向胰岛素样生长因子受体(IGF1R)和靶向转铁蛋白受体(TFR)的Nbs已被研究为通过RMT递送生物制剂到脑部的工具。如靶向人IGF1R细胞外区域的Nbs与非穿越BBB的镇痛神经肽Galanin耦联后显示剂量依赖的镇痛效果[3]。靶向TFR的Nbs与神经活性肽神经肽钠耦联后,经外周注射到小鼠体内,显示出降低小鼠体温的效果[4]。
图2 可介导Nbs通过转胞吞作用穿过BBB的受体蛋白 [5]
通过AMT递送Nbs
据报道少量的Nb可通过AMT通过血脑屏障。这些Nb通常具有更高的pI,例如靶向GFAP的Nb(pI=9.4)、靶向Ab42的R3QV(pI>8.3)和靶向磷酸化Tau蛋白的A2(pI>9.5)。
图3 吸附介导的转胞吞作用示意图 [5]
利用可以穿越血脑屏障的结构递送Nbs
例如靶向谷胱甘肽的PEG化脂质体、多壁碳纳米管(MWCNTs)或Fe3O4纳米颗粒。并且Nbs本身也可以用于改善脑部脂质体的靶向性。另外,细胞穿透肽(CPPs)也可能有助于增加Nbs进入大脑的能力。将Nbs与CPPs融合产生可进入活细胞的细胞渗透性Nbs,可以通过非内吞途径进入活细胞。尽管这种带有正电荷的短氨基酸序列的内部化过程仍存在争议,但它已经显示出有助于单链抗体(scFv)靶向PrPSc和α-突触核蛋白穿越BBB的能力,因此对于Nbs也适用。
其他因素促进Nbs通过BBB
此外,通过物理和化学手段暂时提高血脑屏障的通透性,也可以提高Nbs通过BBB的能力。研究表明,动脉内给药可以增加大脑中Nbs的摄取。甘露醇作为高渗剂,还可以通过削弱BMEC的连接来提高几种Nb融合分子穿过血脑屏障的能力。在最近的一项研究中,发现超声和微泡(USMB)的结合可以增强药物通过体外上皮细胞(MDCK II)屏障的渗透性。USMB处理使上皮细胞对大分子量分子(4~20kDa之间)的通透性增加了3-7倍,同时促进了相同分子的细胞内积累。USMB使抗CXCR4-Nb的细胞间通透性增加一倍,并将其与视网膜母细胞瘤细胞的结合增加了五倍,表明这是一种可能改善药物递送到受组织屏障保护的器官(如BBB)的新途径。大脑温度的升高也是影响血脑屏障结构稳定性的因素之一。除此之外,当BBB被疾病损害时,Nbs穿越BBB的能力自然增强。这就是为什么许多与疾病相关的Nbs研究表明它们可以在BBB完整性受损的病理条件下自发进入大脑的原因。
局部给药方式使Nbs穿透血脑屏障
不太常用的Nb给药方法包括鼻内、鞘内/脑室内给药和其他局部给药方法。例如,据报道,侧脑室注射抑制Aβ分泌酶1(BACE1)的Nb可诱导转基因AD模型小鼠血液和大脑中Ab负荷的急性降低。鞘内注射比脑室内注射诱导的损伤更小,并且已经在中风和神经退行性疾病模型中进行了广泛研究,用以在血脑屏障中输送更大的分子,这也可能是未来在大脑中输送Nb的一种有效方法。Pizzo等分析了鞘内给药后IgG和Nb如何以大小依赖的方式分布在整个大鼠大脑中。两者都分布在大脑表面,两者都在脑表面和所有类型的血管周围的血管周围间隙内扩散,对于较小的Nb来说,进入脑部区域的百分比明显大于较大的IgG。而通过鼻内给药递送的药物可以通过嗅觉神经和三叉神经的细胞内或细胞旁途径穿过血脑屏障,这是一种很好的局部给药方法。
小结
Nb用药方式整体上与传统抗体基本上相似,而由于其较小的分子量以及其他一些特性,使得Nb比传统抗体可以利用多种方式更有效的穿过BBB并在体内产生生物学效应。Nb不仅是研究大脑疾病相关分子的工具,还具有开发成脑部疾病诊断试剂和治疗药物的潜力。在脑部疾病领域,Nbs的应用有许多创新值得深入探索。
参考文献:
[1]. Zheng F, Pang Y, Li L, Pang Y, Zhang J, Wang X and Raes G (2022) Applications of nanobodies in brain diseases. Front. Immunol. 13:978513. doi: 10.3389/fimmu.2022.978513
[2]. Muruganandam A, Tanha J, Narang S, Stanimirovic D. Selection of phage displayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood brain barrier endothelium. FASEB J (2002) 16(2):240–2. doi: 10.1096/fj.01-0343fje
[3]. Alata W, Yogi A, Brunette E, Delaney CE, van Faassen H, Hussack G, et al. Targeting insulin-like growth factor-1 receptor (Igf1r) for brain delivery of biologics. FASEB J (2022) 36(3):e22208. doi: 10.1096/fj.202101644R
[4]. Wouters Y, Jaspers T, De Strooper B, Dewilde M. Identifification and in vivocharacterization of a brain-penetrating nanobody. Fluids Barriers CNS (2020) 17(1) :62. doi: 10.1186/s12987-020-00226-z
[5]. Ruiz-López E, Schuhmacher AJ. Transportation of Single-Domain Antibodies through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jul 31;11(8):1131. doi: 10.3390/biom11081131. PMID: 34439797; PMCID: PMC8394617.
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