肺腺癌胸腔积液上清cfDNA能否用于检测靶向基因突变？

目前，在晚期肺腺癌患者中，胸腔积液细胞学样本可用于检测可靶向治疗突变。然而，成功率较低。对于发生恶性胸腔积液（MPE）的肺腺癌患者，胸腔积液游离DNA（cfDNA）能否用于检测可靶向治疗突变？2017年1月至2021年9月，前瞻性纳入肺腺癌合并MPE患者。评估胸腔积液细胞学或肺癌组织活检样本致癌突变。对胸腔积液和血浆cfDNA进行NGS检测。从42例患者收集了54份胸腔积液样本。胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA样本致癌突变的检测成功率分别为49/54（90.7%）、16/33（48.5%）、22/25（88%）和24/32（75%），P < 0.001。在突变阳性样本中，胸腔积液cfDNA与胸腔积液细胞学样本突变检测结果的一致性为100%，而胸腔积液cfDNA与活检样本突变检测结果的一致性为89.4%。胸腔积液的中位cfDNA浓度（四分位距）高于血浆：28444（4957-67051）vs 2966.5（2167-5025）DNA拷贝/mL，P < 0.01。中位5 mL（四分位距，4.5-5）胸腔积液上清足以进行cfDNA检测。在肺腺癌患者中，胸腔积液cfDNA样本NGS检测的致癌突变检测成功率与肿瘤活检样本相当，高于胸腔积液细胞学和血浆cfDNA样本。胸腔积液cfDNA可以纵向收集，容易纳入临床工作流程，可以减少额外活检。

研究背景

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，2020年有220万新发病例和180万死亡病例。约40%的肺癌患者会出现恶性胸腔积液（MPE），与预后不良和中位生存期为6个月有关。证据表明，酪氨酸激酶抑制剂的使用可改善具有可靶向治疗突变的肺腺癌患者的预后，即使发生MPE。然而，用于鉴定突变的最佳样本的可及性一直是靶向治疗的致命弱点，因为许多样本无法提供足够数量的肿瘤细胞。关于分子检测，肺癌组织活检样本通常被认为是标准，但需要侵入性手术，可能与严重并发症相关。

胸腔积液细胞学样本目前用于诊断癌症和检测可靶向治疗的致癌突变。将胸腔积液离心，恶性细胞沉淀制成细胞块，使用聚合酶链反应（PCR）或NGS分析突变。不幸的是，在不同的研究中，这种策略的检测成功率有限，为54%至71%。亚洲和欧洲患者队列使用胸腔积液上清游离DNA（cfDNA）进行PCR或NGS检测的数据正在出现。我们假设在美国多种族肺腺癌患者队列中，胸腔积液cfDNA的可靶向治疗突变检测成功率高于胸腔积液细胞学。

研究结果

从42例患者收集了54份胸腔积液样本。患者的人口统计学和胸腔积液特征如表1所示。患者的中位年龄（IQR）为67.5（62-78）岁，45.2%为女性。有73.8%的白人和21.4%的黑人患者。先前和当前使用可燃烟草的患者分别有54.8%和4.8%。36例患者有肺癌组织活检样本，其中大多数是通过支气管镜检查（58.4%）获得的，与胸腔积液引流间隔中位（IQR）189（50-666）天。然而，这些肺癌组织活检样本中，只有25份进一步检测了致癌突变。4份胸腔积液细胞学样本检测了PD-L1表达：2份（50%）高表达，1份（25%）低表达，剩余1份（25%）样本不足。19份肺癌组织活检样本检测了PD-L1表达：5份（26.3%）高表达，8份（42.1%）低表达，6份（31.5%）阴性。57.1%的患者置入了留置胸腔导管。治疗包括酪氨酸激酶抑制剂（35.7%）、化疗（61.9%）、免疫治疗（45.2%）、放疗（47.6%）和手术（4.8%）。许多患者接受了两种或以上治疗。95.8%的胸腔积液样本为渗出液。

表1. 患者特征

胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本的突变检测成功率分别为49/54（90.7%）、16/33（48.5%）、22/25（88%）和24/32（75%），P<0.001（表2，图1）。各样本类型中，假阴性和不满足检测条件的样本数量存在差异。2份（3.7%）胸腔积液cfDNA样本检测结果为假阴性，其配对活检或血浆cfDNA样本突变阳性。9份（27.3%）胸腔积液细胞学样本为假阴性，其中7份样本的配对胸腔积液cfDNA检测到突变。2份（6.2%）血浆cfDNA样本假阴性。胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA样本中，分别有5.5%、24.2%、12%和18.7%尝试进行突变检测，但由于质量不足，无法检测。总体而言，胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA样本中，分别有1/54（1.8%）、8/33（24.2%）、2/25（8%）和8/32（25%）遗漏了可以使用酪氨酸激酶抑制剂治疗的可靶向治疗突变（EGFR，KRAS G12C，BRAF V600E，ERBB2，ALK和ROS1重排）。

表2. 不同类型样本致癌突变检测结果

图1. 胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本的检测成功率

在胸腔积液cfDNA和胸腔积液细胞学样本均突变阳性的9例患者中，所有患者两种类型样本的检测结果均一致（表3）。19例患者胸腔积液cfDNA和活检样本突变阳性，其中17例患者（89.4%）两种类型样本的检测结果一致。在检测结果不一致的2例患者中，第一例患者活检样本检出TP53突变，而胸腔积液cfDNA样本检出EGFR Ex19Del；第二例患者活检样本检出BRAF G469V，而胸腔积液cfDNA样本检出NRAS突变。17例患者胸腔积液cfDNA和血浆cfDNA样本突变阳性，其中16例患者（94.1%）两种类型样本的检测结果一致。1例患者检测结果不一致，胸腔积液cfDNA检出EGFR E709A突变，而血浆检出TP53突变。我们还计算了胸腔积液cfDNA与其他样本类型的总体一致性，考虑了所有阳性、阴性、假阴性和不满足检测条件的样本。胸腔积液cfDNA与胸腔积液细胞学样本的总体一致性为51.5%（kappa = 0.11；P = 0.44），胸腔积液cfDNA与活检样本的总体一致性为76%（kappa = 0.32；P = 0.21），胸腔积液cfDNA与血浆cfDNA样本的总体一致性为68.8%（kappa = 0.25；P = 0.06）。

表3. 胸腔积液cfDNA与胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本突变检测结果的一致性

用于cfDNA检测的胸腔积液上清和血浆的中位（IQR）体积分别为5mL（4.5-5）和1.5mL（1-2）。不同样本用于构建文库的cfDNA起始量不同，计算为DNA拷贝/mL，如表4所示。胸腔积液vs血浆的中位（IQR）cfDNA浓度为28444（4957-67051）vs 2966.5（2167-5025）拷贝/mL，P<0.01（表4）。当两个样本均为阳性时，胸腔积液vs血浆的中位（IQR）突变分子数量/mL也不同，为2507（157-42732）vs 26（4-221），P<0.01（表4）。胸腔积液的中位（IQR）VAF%高于血浆，分别为19.14（0.71-50.9）和0.47（0.13-5.56），P<0.01（表4）。

表4. 胸腔积液和血浆cfDNA比较

胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本不同突变的检出率如表5和图2所示。与胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA相比，胸腔积液cfDNA检出更多独特的突变，异质性更高。胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA检出的突变总数分别为98、12、25和29。

表5. 胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本致癌突变检出率

图2. 胸腔积液cfDNA、胸腔积液细胞学、组织活检和血浆cfDNA样本致癌突变检出率

讨 论 

本前瞻性研究评估了美国多种族队列中，胸腔积液cfDNA致癌突变的检测成功率，并将结果与临床可及的样本进行比较，据我们所知，是首个此类研究。与胸腔积液细胞学和血浆cfDNA相比，胸腔积液cfDNA具有更高的检测成功率，特别是对于可靶向治疗突变，检出率与癌症活检样本相似。与血浆cfDNA相比，胸腔积液cfDNA浓度、突变分子数目和VAF也更高。

已知生物学样本用于检测可靶向治疗突变的不充分性。目前用于评估肺腺癌患者胸腔积液中可靶向治疗基因突变的标准是PCR或NGS，使用胸腔积液沉淀中的恶性细胞。肺腺癌患者胸腔积液细胞学样本的致癌突变检测成功率为80.2%，二次胸腔穿刺术可提高至85%。一项研究纳入了56例有MPE且肺腺癌细胞学阳性的患者，约71.4%的患者胸腔积液细胞学样本检测到可靶向治疗突变，85.7%的患者肿瘤活检样本检测到可靶向治疗突变。Carter等人仅在27/50（54%）的腺癌胸腔积液细胞学样本中观察到可靶向治疗突变。如果我们考虑胸腔积液未发现恶性肿瘤细胞，MPE无法检测到突变，则胸腔积液细胞学的突变检测成功率将变得不理想。本研究表明，胸腔积液cfDNA可以检出致癌突变，检测成功率为90.7%，并且与其他样本相比，遗漏的可靶向治疗突变较少。

有研究探索了使用PCR评估肺腺癌患者胸腔积液cfDNA的不同基因突变。Kimura等人的研究纳入了43例日本非小细胞肺癌患者，使用PCR进行胸腔积液cfDNA EGFR突变检测，11例患者检测到突变。Lin等人使用PCR，在15/36例患者的胸腔积液cfDNA、14/36例患者的细胞沉淀中检出EGFR突变。Li等人表明，微滴式数字PCR（ddPCR）检测胸腔积液EGFR突变的灵敏度高于直接测序或扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）。Mokanszki等人评估了36例肺腺癌MPE患者的可靶向治疗突变。使用反向杂交法检测胸腔积液上清cfDNA，在14例患者中检测到EGFR，KRAS和BRAF突变。在对胸腔积液沉淀和血浆进行检测的13例患者中，胸腔积液cfDNA的突变检测成功率为12/13，血浆cfDNA为5/13，胸腔积液细胞块为0/13。Chen等人表明，与组织活检相比，胸腔积液cfDNA EGFR、KRAS和HER2 PCR检测的灵敏度为81.5%。Hummelink等人的研究纳入了37例非小细胞肺癌、结肠癌和阑尾癌患者，收集了44份MPE上清cfDNA样本，使用ddPCR检测EGFR和KRAS突变，35份样本（79.5%）检出。本研究使用NGS进行胸腔积液cfDNA分析，扩展了已发表的文献。

NGS已成为一种强大的高通量基因组分析工具，用于评估癌症的分子图谱。Villatoro等人的研究纳入了来自意大利和西班牙中心的42份不同体液样本，包括12 份MPE，发现与血浆相比，体液cfDNA PCR或NGS的突变检测成功率较优，浓度和突变丰度也更高。Tong等人的研究纳入了63例中国非小细胞肺癌患者，使用NGS对胸腔积液上清、沉淀和血浆进行检测，评估cfDNA的突变检测成功率。在有匹配组织活检样本的患者中，上清、沉淀和血浆cfDNA的突变检测灵敏度分别为93%、90%和63%。与沉淀或血浆相比，上清cfDNA浓度较高，并且相比其他样本，表现出更独特的突变谱。在另一项亚洲队列研究中，使用NGS对77例患者的MPE样本进行检测，上清cfDNA和沉淀的突变检测成功率和最高突变丰度没有差异。本研究结果与已发表的文献一致，尽管队列种族更加多样化。

本研究使用了NGS，胸腔积液cfDNA的检测成功率为90.7%，分别高于胸腔积液细胞学、活检和血浆cfDNA的48.4%、88%和72.7%。在突变阳性的患者中，胸腔积液cfDNA与胸腔积液细胞学检测结果完全一致，与活检85%一致，与血浆cfDNA 94.1%一致。当考虑假阴性和不满足检测条件的样本时，胸腔积液cfDNA与其他样本的总体一致性或kappa值较低。我们推测，胸腔积液cfDNA和活检或血浆的一些不一致可能与胸腔积液vs原发性肿瘤的突变谱、不同组织区域的动力学或胸腔积液引流与活检的时间存在差异有关。

我们还观察到，cfDNA突变分析几乎可以对所有患者进行，只需5mL的MPE上清。Abouzgheib等人先前的一项研究表明，50 mL的胸腔积液足以确定癌细胞。其他研究表明，基于细胞学方法，50至100 mL胸腔积液也足以评估基因突变。我们观察到，5 mL胸腔积液上清可能足以用于NGS基因突变检测，这是一个关键发现，因为这种有限的体积可以很容易地使用标准收集程序纳入当前工作流程。

另外，与血浆cfDNA相比，胸腔积液cfDNA浓度、突变数目和VAF更高。这可能是由于胸膜肿瘤直接脱落cfDNA，与血浆相比，胸腔积液中cfDNA的稀释或去除较少。与血浆相比，胸腔积液中较高的cfDNA浓度可能提高了胸腔积液cfDNA的突变检测成功率。本研究的另一个重要发现是胸腔积液cfDNA检出更多独特的突变，这可能反映同一患者不同部位的不同分子谱。因此，胸腔积液可以促进更全面的分子分析和克隆异质性评估。

本研究的优势包括前瞻性设计，纳入了多种族队列，以及比较了胸腔积液cfDNA NGS与临床诊断方式。本研究的局限性包括来自单中心的样本量小，且无法从许多患者获取足够的血浆量。使用机构和商业NGS检测对致癌突变的临床评估是异质性的，不是所有胸腔积液细胞学和组织活检样本都进行了检测，因为通常使用两种样本类型中的一种评估突变。此外，未检测胸腔积液上清或血浆cfDNA CD274（PD-L1）基因扩增，该指标可作为免疫治疗疗效预测因子，未来的研究应评估CD274基因扩增。

本研究结果表明，在肺腺癌中，胸腔积液cfDNA样本NGS检测的致癌突变检测成功率与肿瘤组织活检样本相当，高于胸腔积液细胞学和血浆cfDNA样本。胸腔积液cfDNA浓度、VAF和分子异质性也高于血浆。常规使用胸腔积液cfDNA或可改善肺腺癌的临床基因检测结果，尽管未来需要进一步验证。

参考文献：

Mahmood K, Jampani P, Clarke JM, Wolf S, Wang X, Wahidi MM, Giovacchini CX, Dorry M, Shofer SL, Shier J, Jones G, Antonia SJ, Nixon AB. High Yield of Pleural Cell-Free DNA for Diagnosis of Oncogenic Mutations in Lung Adenocarcinoma. Chest. 2023 Jul;164(1):252-261. doi: 10.1016/j.chest.2023.01.019. Epub 2023 Jan 21. PMID: 36693563; PMCID: PMC10331627.

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