科研丨北京协和医院＆儿童医院: 口腔微生物组衍生的特征使喉癌的非侵入性诊断成为可能(国人佳作)

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   

最近的研究发现，头颈癌患者体内的微生物群发生了显著变化，可能会推动癌症的发展。然而，关于喉鳞状细胞癌(LSCC)独特微生物群的研究数据有限，关于口腔微生物群是否可以作为早期诊断生物标志物也知之甚少。本研究采用16S rRNA基因测序，对77名LSCC患者和76名声带息肉对照患者的口腔冲洗液和组织样本的微生物组进行了表征，然后进行了生物信息学分析，以确定与临床病理特征相关的分类群。结果表明，当按组织学和组织类型进行分层时，多个细菌属的相对丰度存在显著差异。通过利用LSCC和声带息肉患者之间不同的微生物丰度并鉴定肿瘤相关微生物群分类群，开发了一种预测分类器，将冲洗液微生物群作为诊断LSCC的关键特征，准确率达到85.7%。这是第一个基于口腔冲洗液微生物组的分类特征用来诊断LSCC的证据。本研究结果表明，口腔冲洗液微生物组是临床变异的一个未充分研究的来源，是LSCC的潜在非回避性生物标志物。    

论文ID

原名：Oral-microbiome-derived signatures enable non-invasive diagnosis of laryngeal cancers

译名：口腔微生物组衍生的特征使喉癌的非侵入性诊断成为可能

期刊：Journal of Translational Medicine

IF：7.4

发表时间：2023.7

通讯作者：陈兴明，张鹏

通讯作者单位：中国医学科学院北京协和医院；首都医科大学附属北京儿童医院

DOI号：10.1186/s12967-023-04285-2

实验设计

前言

人体内蕴藏着数万亿种微生物，它们具有与健康密切相关的各种功能。口腔是微生物最大的栖息地之一，有1000多种不同的微生物。大量研究表明，口腔微生物谱及其代谢产物的改变与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、食管癌有关，并可能通过消化道影响远端器官，从而导致结直肠癌、胰腺癌、肺癌的发生。通过广泛的研究，已经确定了一些与口腔/口癌相关的特定分类群，如Fusobacterium、Peptostreptococcus、Prevotella、Veillonella、Capnocytophaga等。已经提出了口腔细菌致癌作用的几种机制。第一种是细菌刺激慢性炎症。厌氧物种，如梭杆菌、普雷沃氏菌和卟啉单胞菌是牙周病的罪魁祸首，并导致慢性炎症，这可能促进细胞增殖、血管生成和癌基因激活。第二种机制涉及抗凋亡活性。牙龈卟啉单胞菌等细菌通过调节多种途径抑制细胞凋亡。第三种机制是直接或间接产生致癌物质。几种口腔细菌能够将酒精代谢为致癌物质乙醛。此外，某些细菌的遗传毒性代谢物可能导致DNA损伤或产生自由基，影响活性氧(ROS)。喉鳞状细胞癌(LSCC)是所有呼吸系统癌中仅次于肺癌的第二大常见肿瘤。LSCC在HNSCC中也很常见。据估计，2020年全球约有184615例新发病例和99840例死亡归因于LSCC。然而，由于缺乏早期检测，大多数患者在诊断时已发展为晚期LSCC，即使在手术切除后也常导致局部复发和远处转移。LSCC的发病机制尚不完全清楚，一些风险因素与LSCC有关，如吸烟、饮酒和人乳头瘤病毒(HPV)感染。最近，对头颈癌的几项研究表明，微生物群的改变可能会驱动HNSCC，并鉴定出一些潜在的致癌细菌。然而，以往研究头颈癌微生物组的工作主要集中在口腔/口咽癌。关于探索癌症独特微生物群的数据非常有限，此外，口腔微生物群能否作为无创性早期检测的生物标志物尚未研究。口腔冲洗液中的口腔微生物组因其解剖位置接近而被认为是研究口腔/口咽癌微生物群的良好工具。它也是一种很有前景的生物标记物，可用于低成本和无创性早期癌症检测。由于口腔微生物群可通过吸入和吞咽迁移到喉咽区域，本研究旨在通过组织样本和口腔冲洗液样本确定LSCC患者的微生物组变化，并探讨口腔微生物群是否可以作为LSCC患者的非回避诊断标志物。

结果

1、LSCC中肿瘤和口腔微生物组的多样性生态失调

本研究于2020年至2022年在北京协和医院(PUMCH)共纳入153例患者。大多数患者年龄在56至70岁之间(66.0%)，患者的平均年龄为60.4岁。男女比例为8.6:1(137名男性:16名女性)。根据癌症统计数据，喉癌在男性中的发病率高于女性，最常见于55-74岁人群。本研究中LSCC患者的男女比例和年龄范围与文献中喉癌的流行病学大致相符。整个队列的基线特征如表1所示。如图所示，LSCC组和对照组在年龄或性别方面没有显著差异。吸烟者和饮酒者在LSCC组中更为常见，这是不可避免的。群落α多样性采用观察到的分类单元(OTUs)、Simpson、Shannon和Chao1指数进行评估(图1A)。不同组之间α多样性指数的统计P值如附加文件1：表S1所示。与肿瘤组和对照组的组织样本相比，口腔冲洗液样本的微生物多样性指数均有所升高(Simpson指数、Shannon指数和观察到的OTUs，P值<0.05)。肿瘤组织的Simpson指数和Shannon指数显著高于对照组织。虽然口腔冲洗液样品在肿瘤组和对照组之间α-多样性没有显示出显著差异，但值得注意的是，口腔冲洗液样本的组内变异低于组织样本。然后，基于属剖面的Bray-Curtis距离矩阵进行主坐标分析(PCoA)，以研究β-多样性。如图1B所示，口腔冲洗液样品彼此紧密聚集，并与组织样品分离，其中基于置换多元方差分析(PERMANOVA)发现肿瘤组织和对照组织样品之间有明显差异。总之，与喉部组织样本相比，口腔冲洗液样本的组内变异较小。

表1. 研究队列的人口统计学和临床特征。

图1. LSCC(N = 77)和对照样品(N = 76)的微生物群多样性。

A.各组间微生物α-多样性的比较。P值由Wilcoxon秩和检验计算。用“+”表示P < 0.01，“*”表示P < 0.05。B.主坐标分析(PCoA)图。P值来源于置换多元方差分析(PERMANOVA)。

2、LSCC肿瘤样品和口腔冲洗液样品的微生物组成变化

随后，比较LSCC患者样本和对照患者样本前20个分类群的相对丰度(图2)。在属水平上，与对照组织相比，肿瘤组织中梭杆菌属(Fusobacterium)(0.088 ± 0.115 vs. 0.022 ± 0.028，肿瘤vs.对照组织)、假单胞菌属(Pseudomonas)(0.083 ± 0.160 vs. 0.055 ± 0.101)和不动杆菌属(Acinetobacter)(0.055 ± 0.127 vs. 0.003 ± 0.013)的比例要高得多，而罗尔斯顿菌属(Ralstonia)(0.016 ± 0.026 vs. 0.233 ± 0.241)是大多数对照组织的主要成分，但在肿瘤组织中很少。口腔冲洗液样本显示出相似的微生物组组成，并且在肿瘤组和对照组中具有相同的特征(普雷沃氏菌(Prevotella)、奈瑟菌(Neisseria)、链球菌(Streptococcus)、嗜血杆菌(Haemophilus)和Alloprevotella)，这也意味着与喉部组织样本相比，口腔冲洗液样本组内变异更低。正如预期的那样，在不同的样本组之间发现了属水平上微生物群组成的显著差异(图3A)。与对照组织相比，肿瘤组织中黄杆菌属(Flavobacterium)(P = 0.008，0.003 ± 0.007 vs. 0.000 ± 0.000，肿瘤vs.对照组织)、克雷伯氏菌(Klebsiella)(P = 0.002、0.017 ± 0.038 vs. 0.000 ± 0.001)、支原体(P = 0.001、0.002 ± 0.011 vs. 0.000 ± 0.000)等属的丰度明显增加，而罗尔斯顿菌属的丰度(P = 0.000、0.012 ± 0.026 vs. 0.233 ± 0.241，肿瘤vs.对照组织)、放线杆菌属(Actinobacillus)(P = 0.0000.000 ± 0.000 vs. 0.002 ± 0.005)、链球菌属(P = 0.000，0.024 ± 0.039 vs. 0.151 ± 0.238)、乳杆菌属(P = 0.0000.002 ± 0.006 vs. 0.010 ± 0.035)、罗斯氏菌属(Rothia)(P = 0.002、0.003 ± 0.006 vs. 0.015 ± 0.041)和其他几个属在肿瘤组织中的丰度明显较低。在口腔冲洗液样品中，Saccharopolyspora(P = 0.018，0.001 ± 0.003 vs. 0.000 ± 0.002，肿瘤vs.对照冲洗液)和放线杆菌属(P = 0.008、0.019 ± 0.050 vs. 0.005 ± 0.010)在肿瘤患者中比在对照患者中更丰富。热图根据相对丰度进行着色(图3B)，显示了四个样本组(肿瘤组织样本、对照组织样本、LSCC患者的口腔冲洗液样本和对照患者的口腔冲洗液样本)之间的属差异。本研究发现组织样品与口腔冲洗液样品分离，肿瘤组织样品不同于对照组织样品。韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属、罗尔斯顿菌属等促成了这种分离。此外，仅在组织样本的差异分析中观察到39个属(纤毛菌属(Leptotrichia)、韦荣氏球菌属、Solobacterium等；如图3B所示)。仅在口腔冲洗液样品的差异分析中观察到3个独特的属，Alistipes、Selenomonas和Saccharopolyspora。在口腔冲洗液和组织样本的差异分析中检测到4个属，即L.NK4A136、Alicycliphilus、放线杆菌属(Actinobacillus)和Moraxella。关于不同组间属的百分比值和统计P值的更多详细信息，请参见附加文件1：表S2。

图2. LSCC(N = 77)和对照样品(N = 76)中的优势属。显示了不同组中前20个优势属的相对丰度。根据前20个属的丰度分布，使用R中的“hclust”函数对每组样本进行聚类和排序。

图3. LSCC肿瘤组织和口腔冲洗液样品中微生物组成的差异。

A.肿瘤组织和对照组织样本之间菌属的Log2倍数变化(Log2FC)有显著差异(上图)；肿瘤患者的口腔冲洗液样本和对照患者的口腔冲洗液样本之间菌属Log2FC存在显著差异(下图)。Log2FC>0表明该属在肿瘤患者中比在对照患者中更丰富，而log2FC < 0表明该属在肿瘤患者中的丰度低于对照患者。B.根据A中差异属的丰度绘制的彩色热图。 

3、基于口腔冲洗液微生物群的LSCC诊断分类模型

本研究结果表明，在LSCC组和对照组的口腔冲洗液样本中，几个分类群的丰度存在显著差异。因此，口腔微生物群有可能成为提示LSCC风险的预测标志物。为了验证这一假设，首先在属水平上选择微生物生物标志物，使用十倍交叉验证，基于121个样本的训练集重复五次(表1)。然后，利用来自组织样本(N = 61)和口腔冲洗液样本(N = 60)的训练集，从选定的生物标志物中训练两个随机森林(RF)模型。通过受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)来评估所构建模型的性能。共有15个属被鉴定为微生物生物标志物，包括Candidatus Saccharimonas、罗尔斯顿菌属、Moraxella、Solobacterium、奈瑟菌属、链球菌属、韦荣氏球菌属和其他8个属，可以在组织样本(图4A)和口腔冲洗液样本(图4B)中区分LSCC患者和对照患者，表明微生物特征在LSCC鉴定中的潜在用途。

其中，基于训练集(AUC = 98.1%)和测试集(N = 16，AUC = 83.3%)的组织样本模型表现出了良好的性能(图4A)。有趣的是，与之前使用组织样本的模型相比，基于测试集，口腔冲洗液样本的RF模型显示出更高的AUC(N = 16，AUC = 85.7%)，基于训练集显示出更低的AUC(AUC = 86.4%)(图4B)，支持了本研究基于口腔微生物群的分类器对LSCC的潜在诊断价值。此外，还研究了15种微生物生物标志物基于PCoA和PERMANOVA区分LSCC的潜在能力，观察到LSCC组和对照组之间存在显著的分离(PERMANOVA，P < 0.05)。

图4. 通过随机森林模型识别临床诊断微生物标志物。

A.使用组织样本中15种选定生物标志物的图谱，RF模型中变量的平均准确度下降(MDA)(左)。ROC曲线是基于组织样本的训练集和测试集(中间)。AUC显示在右下角。PCoA基于组织样本中15个选定属的图谱(右)。P值来源于PERMANOVA。B.基于口腔冲洗液样本的RF模型，15种选定生物标志物的MDA(左)、ROC曲线和AUC(中)。基于口腔冲洗液样本中15个选定属的图谱的PCoA和PERMANOVA(右)。  

讨论

虽然口腔微生物群在口腔/口咽癌中的作用受到了广泛关注，但很少有文献研究微生物改变与喉癌之间的关系。没有一项研究同时包括口腔冲洗液/唾液样本和组织样本，以研究LSCC患者口腔微生物群和喉部微生物组成的变化。本研究包括两种样本类型，以研究口腔冲洗液样本是否可以替代微生物组研究中的组织样本，并作为LSCC患者的早期诊断标志物。本研究表明，尽管与组织样本相比，口腔冲洗液样本的微生物多样性指数显著升高，并且在肿瘤组和对照组之间α-多样性和β-多样性没有显著差异，但与喉部组织样本相比，口腔冲洗液样本的组内变异较小，这表明了它们可作为稳定诊断生物标志物的潜在特征。与对照组织相比，LSCC组喉部组织中几个属的丰度显著较高，包括一些臭名昭著的属，如梭杆菌属，这与先前的研究一致。梭杆菌是一种侵袭性厌氧菌，主要与牙周炎有关，牙周炎可能导致慢性炎症并有助于癌变。最近，越来越多的研究发现梭杆菌的丰度与癌症之间存在关联，包括口腔/口咽癌、结直肠癌等。然而，在口腔冲洗液样本中，肿瘤组和对照组之间的分类群差异并没有基于组织样本的差异大，但基于训练集和测试集，使用口腔冲洗液样本中微生物生物标志物的RF模型表现出优异的性能，表明了基于口腔微生物群的分类器对LSCC的诊断价值。 

值得注意的是，之前的研究没有证明基于微生物群的模型可以通过口腔冲洗液样本可靠地检测喉癌，具有较高的敏感性和特异性。本研究确定了分类特征，产生了一个模型，并开发了一个能够区分癌症状态的分类器。本研究结果表明，口腔微生物组的变化可以作为内窥镜或CT扫描检测到的临床表型之前的标志物。由于这项研究描述了诊断为喉癌的患者队列，未来的工作应检查这一特征是否可用于评估癌前病变(如声带白斑)个体的癌症发病情况。这是一个很好的临床终点，因为该模型能够通过对口腔冲洗液样本进行简单的分类群定量测试进行无创LSCC检测。本研究的结果为开发基于微生物组的液体活检技术提供了强有力的理论依据，以优先考虑临床关注的高风险个体。 

虽然这不是揭示LSCC患者特定微生物组成的初步研究，但我们的研究是第一项包括多种样本类型并调查口腔冲洗液样本是否可以替代微生物组研究中的组织样本的研究。应该承认本研究中固有的几个不可避免的局限性。首先，这是一项在单一机构进行的回顾性研究，因此可能存在选择偏倚。其次，虽然年龄和性别在两组中匹配，但在本研究中不能消除吸烟和饮酒对微生物群的影响。吸烟和饮酒可能会改变口腔微生物组成，并可能导致自然选择具有高致癌物代谢率的微生物群，这可能与癌症发病机制中的主要风险因素(如酗酒和吸烟)协同作用。在本研究中，对照组吸烟者和非吸烟者口腔冲洗液无属间差异，对照组饮酒者和非饮酒者的口腔冲洗液微生物差异分析中仅发现一个属(Ralstonia)。总之，作者认为本研究中吸烟和饮酒对口腔冲洗液微生物群的影响有限，因此基于口腔冲洗液微生物群的LSCC诊断分类模型是可靠的。将对更多患者进行进一步研究，以便进行亚组分析。

结论

通过对α和β多样性的分析，本研究发现与喉部组织样本相比，口腔冲洗液样本呈现出较低的组内变异，这表明其作为稳定诊断生物标志物的潜在特征。本研究结果证明，口腔微生物组生态失调是LSCC的一个关键标志，基于口腔微生物群的模型在区分LSCC样本方面表现出优异的性能。据我们所知，这是第一项通过使用基于口腔微生物群的模型为LSCC的非侵入性预测提供策略的研究，代表了LSCC患者的一种有前景的早期诊断生物标志物，可供未来临床使用。 

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