miR-205-3p在氧糖剥夺-复氧复糖星形胶质细胞胀亡中的作用：与AQP4的关系

本文原载于《中华麻醉学杂志》 2022年第6期

缺血性脑卒中是一种由于脑或颈部血管阻塞导致脑血流不足而引起的破坏性脑血管疾病[1]，其恢复血流后的再灌注损伤会造成更严重的脑组织和神经细胞损伤[2]。脑缺血发生后会进一步导致脑水肿，脑水肿包括血管源性水肿和细胞毒性水肿。其中细胞毒性水肿是由于星形胶质细胞的功能障碍引起大量水分子进入细胞，进而引起细胞水肿[3]。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，在维持微环境的稳定性和神经回路功能方面发挥着至关重要的作用[4,5]，且其水通道蛋白4(AQP4)的表达与细胞水肿程度关系密切[6]，可导致星形胶质细胞胀亡[6,7]。MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性非编码RNA，以大多数蛋白质编码转录本为靶标，可参与各种关键的病理生理过程。研究表明，异常miRNAs的表达在缺血性脑卒中和其他病理过程中发挥重要作用[8]。miR-205在多种细胞中均有表达，如神经细胞[9]、肾细胞等[10，且miR-205已被证明在大鼠缺血缺氧性脑损伤中表达下调[11]。本研究拟评价miR-205-3p在氧糖剥夺-复氧复糖(OGD/R)星形胶质细胞胀亡中的作用及其与AQP4的关系，为明确其机制提供参考。

材料与方法

原代星形胶质细胞的培养　

本研究获医院医学伦理委员会批准(批准号：2022临审字第021号)。取0～2 d新生昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒后，断头取大脑皮层组织，剥除脑膜和血管，反复轻柔吹打制成细胞悬液，过滤，收集滤液，转入75 ml培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱(Gibco公司，美国)中静置培养。加入0.25%胰酶于37 ℃温箱中消化，加入完全培养基终止消化，离心收集细胞沉淀，重悬于完全培养基中，接种于培养瓶，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。每2 d换1次液，7 d后37 ℃、180转/min震荡18 h换液，待细胞达到对数生长期(密度约80%～90%)时传代，第3代时得到成熟纯化的星形胶质细胞，用GFAP行免疫荧光法鉴定，荧光显微镜下星形胶质细胞比率>95%，用于后续实验。将纯化的星形胶质细胞种植于24孔板中，加入4%多聚甲醛(碧云天生物科技有限公司)固定30 min，PBS反复漂洗细胞，先后采用0.1%Triton X-10(碧云天生物科技有限公司)破膜、5%BSA(碧云天生物科技有限公司)封闭细胞，孵育相应一抗GFAP抗体(稀释度1∶1 000，Abcam公司，英国)，4 ℃过夜。次日避光孵育相应二抗(稀释度：1∶500，碧云天生物科技有限公司)，PBS漂洗后孵育DAPI(碧云天生物科技有限公司)，最后使用抗荧光淬灭剂封片(碧云天生物科技有限公司)，运用共聚焦显微镜采集图像，图像采用Image J软件分析。采用随机数字表法分为5组(n＝16)：对照组(C组)、OGD/R组(O组)、OGD/R+miR-205-3p模拟物组(M组)、OGD/R+miR-205-3p抑制剂组(I组)和OGD/R+miR-205-3p阴性对照组(NC组)。

细胞转染

由广州锐博生物技术有限公司提供miR-205-3p模拟物，miR-205-3p抑制剂和阴性对照，参照riboFECT™CP转染试剂说明书根据实验浓度将其分别与星形胶质细胞于37 ℃、5%CO 2 的培养箱中共培养48 h，48 h后使用qRT-PCR法检测转染成功。 

制备星形胶质细胞OGD/R模型　 

采用10%胎牛血清配置的DMEM/F12培养基培养星形胶质细胞，当细胞生长状态良好时，将各组细胞的完全培养基换为无糖培养基，并将细胞培养板置于37 ℃厌氧孵育箱(含94%N2、1%O2和5%CO2)氧糖剥夺4 h，无糖培养基更换为正常培养基，继续培养24 h。 

qRT-PCR法检测星形胶质细胞AQP4 mRNA和miR-205-3p的表达　 

于复糖复氧24 h时，各组随机取5孔细胞，根据Trizol试剂说明书步骤提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度合格，－80 ℃保存备用。采用Takara逆转录试剂盒将总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，产物进行PCR。使用miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技有限公司)提取细胞miRNA，紫外分光光度计测定RNA浓度合格，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)将miRNA逆转录成cDNA，产物进行PCR。分别使用miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)和mRNA的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(Takara公司，日本)制备PCR反应体系，并于ABI7300荧光实时定量聚合酶链反应仪(CA公司，美国)检测AQP4 mRNA和miR-205-3p表达。AQP4引物：上游5′-TCAGCATCGCTAAGTCCGTC-3′，下游：5′-CGTGGTGACTC-CCAATCCTC-3′，内参为GAPDH(上海生工生物工程股份有限公司)。miR-205-3p引物：上游5′-CTTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′，内参为U6(上海生工生物工程股份有限公司)。采用2-ΔΔCT法计算AQP4 mRNA和miR-205-3p的相对表达量。 

Western blot法检测星形胶质细胞AQP4与胀亡蛋白porimin的表达　 

于复氧复糖24 h时，各组随机取3孔细胞，分别消化，加入RIPA细胞裂解液，在冰浴条件下裂解细胞。提取各组细胞总蛋白后用BCA法检测蛋白浓度。使用SDS聚丙酰胺凝胶孔槽，电泳，确定目标蛋白的片段大小及位置后切胶，转印聚偏乙烯膜，加封闭液室温封闭1 h，加入目标蛋白一抗AQP4(稀释度1∶2 500，Sigma公司，美国)、porimin(稀释度1∶500，Immunoway公司，美国)4 ℃孵育过夜，二抗(稀释度1∶1 000，北京中杉金桥科技公司)室温孵育2 h，以β-actin(稀释度1∶10 000，武汉三鹰生物技术有限公司)为内参。化学发光法显现蛋白条带并照像，Image J软件分析灰度值，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达。 

细胞活力的测定　 

采用CCK-8法，各组随机取5孔处于对数生长期细胞，每孔加入单细胞悬液100 μl，空白孔加入等量的培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，于复氧复糖24 h后于各组加入10 μl CCK-8溶液(碧云天生物科技有限公司)，避光温箱孵育1 h后，置于酶标仪(PerkinElmer公司，美国)用450 nm单波长测吸光度值(OD值) ，细胞活力＝(实验组OD值－空白组OD值)÷(对照组OD值－空白组OD值)，采用不同繁殖批次细胞重复5次实验，取其平均值。 

流式细胞术　 

于复氧复糖24 h时，各组随机取3孔细胞，根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)说明书收集处理各组细胞，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞后加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。再加入10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀后室温避光孵育15 min，随后立即用流式细胞仪检测各组星形胶质细胞损伤和胀亡情况。

统计学处理　

采用SPSS 25.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结　果

使用Targetscan数据库预测AQP4的上游靶点，结果表明，miR-205-3p与AQP4 3′-非翻译区(UTR)存在结合位点。见表1。

表1 Targetscan分析预测miR-205-3p与AQP4 3′UTR的关联

注：AQP4为水通道蛋白4

与C组相比，O组miR-205-3p表达下调，porimin表达上调，细胞活力降低(P<0.05)；与O组相比，M组miR-205-3p表达上调，porimin表达下调，细胞活力升高，I组miR-205-3p表达下调，porimin表达上调，细胞活力降低(P<0.05)，NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2

五组细胞miR-205-3p、porimin表达及细胞活力的比较

表3与C组相比，O组星形胶质细胞AQP4及其mRNA表达上调，细胞损伤率及胀亡率升高(P<0.05)；与O组相比，M组星形胶质细胞AQP4及其mRNA表达下调，胞损伤率及胀亡率降低，I组星形胶质细胞AQP4及其mRNA上调，细胞损伤率及胀亡率升高(P<0.05)，NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

五组细胞AQP4及其mRNA表达、细胞损伤率和胀亡率的比较

讨　论

注：AQP4为水通道蛋白4

本研究采用厌氧孵育箱(含94%N2、1%O2和5%CO2)氧糖剥夺4 h，无糖培养基更换为正常培养基，继续培养24 h的方法制备星形胶质细胞OGD/R模型，结果表明，与C组相比，O组细胞活力降低，细胞损伤率及胀亡率升高，提示模型制备成功。

星形胶质细胞在脑中广泛存在，是中枢神经系统中数量最多的神经胶质细胞，可合成和分泌多种细胞因子，具有营养支持神经元、维持血脑屏障完整、调控细胞微环境等神经保护作用[12,13]。星形胶质细胞胀亡的发生可引起细胞毒性水肿，细胞毒性水肿是引起脑水肿的原因之一。脑水肿是缺血性脑卒中潜在的一种严重并发症[14]。AQP4是中枢神经系统中水通道蛋白的主要亚型，是大脑中丰富的水通道，在星形胶质细胞中高表达，主要分布于星形胶质细胞的终足处[15]，是脑水肿发生过程的主要参与者，星形胶质细胞发生细胞毒性水肿的过程依赖于AQP4的表达[16]。AQP4参与脑脊液的形成和重吸收，维持脑稳态，是调节星形胶质细胞功能的关键蛋白。研究表明，AQP4的表达下调或缺失会导致星形胶质细胞功能障碍，如细胞膜水通透性下降[17]，细胞生长和迁移功能受损[18]等。porimin是一种高度糖基化的跨膜受体蛋白，属于细胞膜相关粘蛋白家族。其可导致细胞发生一种独特形式的死亡方式即胀亡。当在缺氧、供能不足等情况下，porimin可被激活，迅速与其配体抗-porimin mAb结合，通过引起各种膜性结构的损伤如细胞膜通透性增加等，进而发生细胞胀亡。在细胞发生胀亡时，porimin可被激活[19]，特异性地表达在将要发生胀亡的细胞表面[20]。本研究结果表明，与O组相比，M组miR-205-3p表达上调，细胞活力升高，细胞损伤率及胀亡率降低，AQP4及其mRNA和porimin表达下调，I组miR-205-3p表达下调，细胞活力降低，I组细胞损伤率及胀亡率升高，AQP4及其mRNA和porimin表达上调，结合miR-205-3p与AQP4 3′-UTR存在结合位点，提示miR-205-3p参与了OGD/R星形胶质细胞胀亡的过程，与调控AQP4表达有关。

综上所述，miR-205-3p参与了OGD/R星形胶质细胞胀亡的过程，与调控AQP4表达有关。

利益冲突

所有作者声明无利益冲突

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END

编辑：Michel.米萱

校对：MiLu.米鹭

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