科研丨PHARMACEUTICS: 乳酸片球菌pA1c®通过控制血糖和调节肠道菌群改善二甲双胍治疗2型糖尿病的有益效果

编译：微科盟yl

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

2型糖尿病(T2D)是一种复杂的代谢性疾病，涉及持续的高血糖。二甲双胍给药是糖尿病患者最常用的治疗方法。在之前发表的一项研究中，证明了Pediococcus acidilactici pA1c®(pA1c)可防止HFD诱导的糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和体重增加。本研究旨在评估在HFD诱导的T2D小鼠模型中，pA1c、二甲双胍或两者联合给药16周可能产生的有益影响。结果发现，联合用药可缓解高血糖，增加胰腺和HOMA-β的高强度胰岛素阳性区域，降低HOMA-IR，并且比二甲双胍(涉及HOMA-IR、血清C-肽水平、肝脂肪变性或肝脏Fasn表达)或pA1c(涉及体重或肝脏G6pase表达)治疗提供了更多的有益效果。这三种治疗对粪便微生物群有显著影响，导致共生菌群组成存在差异。综上所述，本研究表明，P. acidilactici pA1c®给药提高了二甲双胍治疗T2D的有益效果，这将是治疗T2D的一种有价值的治疗策略。    

论文ID

原名：Pediococcus acidilactici pA1c® Improves the Beneficial Effects of Metformin Treatment in Type 2 Diabetes by Controlling Glycaemia and Modulating Intestinal Microbiota

译名：乳酸片球菌pA1c®通过控制血糖和调节肠道菌群改善二甲双胍治疗2型糖尿病的有益效果

期刊：Pharmaceutics

IF：5.4

发表时间：2023.4

通讯作者：Miguel Barajas，Miriam Araña

通讯作者单位：西班牙纳瓦拉公立大学

DOI号：10.3390/pharmaceutics15041203

实验设计

40只11周龄的雄性C57BL/6小鼠饲喂标准饲料1周。将动物随机分为四组(每组n=10)：(1)对照组(Co组)，接受HFD；(2)二甲双胍组(Met组)，接受HFD+二甲双胍；(3) pA1c组(pA1c组)，接受HFD+含pA1c的益生菌制剂；(4)接受HFD+二甲双胍和含pA1c的益生菌制剂(Met+pA1c组)。每周记录体重、空腹血糖，在14周时进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)，每2周监测一次食物摄入量。在研究结束(17周)时，所有动物在禁食12小时(过夜)后处死，采集粪便、血液和组织样本(肝脏、胰腺和小肠)，随后进行血清生化分析(ALT、AST、TC、NEFAs、TG等)、组织学分析，宏基因组测序分析粪便微生物群组成。

图1. 实验设计。

结果

1二甲双胍、pA1c及其组合可减轻HFD喂养小鼠的体重增加

从第1周到研究结束，二甲双胍和pA1c对体重的影响存在显著差异。图2A显示Co组的BW急剧上升，而其他组的BW进展较为平稳。研究发现，除第7周外，Co组和pA1c组在第3周到第17周之间存在差异。此外，从第1周到第17周，Co组与Met和Met+pA1c组之间存在差异。给药二甲双胍的两个组(Met和Met+pA1c组)在第1周BW急剧下降，这与二甲双胍治疗的开始相吻合。 从第1周开始，每2周记录每组的食物摄入量。值得注意的是，给药二甲双胍的两组(Met组和Met+pA1c组)的BW在第1周有所下降，两组的食物摄入量在第3周达到峰值(图3A)。然而，在那之后，这种影响消失了，这表明动物已经适应了二甲双胍，并且食物消耗量下降到更接近Co和pA1c组的值。分析表明，所有研究组的食物摄入量相似。

研究开始时，两组的BW无统计学显著差异，但在研究结束时发现各组之间存在很大差异(p<0.001)。如图2B所示，Co组体重显著高于其他组(45.7±1.9 g；与所有组相比p<0.001)，pA1c组(35.2±3.5g)的体重明显大于二甲双胍组(Met组：31.2±2.9 g；Met+pA1c组：31.2±1.5 g；与Met和Met+pA1c组相比，p<0.01)。将每组的平均BW增加估计为相对于基线BW的变化(%)。数据显示，Co组的动物表现出最大的体重增加(78.2±14.6%)，显著高于其他组(与Co组相比，Met组：30.6±15.9%，p<0.001；pA1c组：36.5±14.9，p<0.05；Met+pA1c组：22.8±14.2%，p<0.001)。Met组、pA1c组和Met+pA1c三组具有可比性。

图2. (A)体重变化(平均值±SD，每组n=10只小鼠)和(B) 散点图表示研究结束时的体重 。**p<0.01；***p<0.001；a代表Co与pA1c组的显著差异；b代表Co与Met组和Co与Met+pA1c的显著差异。

图3. (A)整个研究过程中FBG的进展(平均值±SD，每组n=10只小鼠)。(B)散点图表示研究结束时的FBG；(C)第14周的IPGTT；(D)第14周的总葡萄糖AUC；研究结束时(E)血清C肽、(F) HOMA-IR和(G) HOMA-β(每组n=9-10只小鼠)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；a代表Co与pA1c组的显著差异；b代表Co vs. Met组和Co vs. Met+pA1c的显著差异；c代表Met与pA1c组的显著差异；d代表Met与Met+pA1c组的显著差异。

2pA1c及其与二甲双胍联用比二甲双胍更好地缓解葡萄糖失调、减轻胰岛素抵抗和维持胰腺β细胞功能

从第二周开始，Co组的FBG值似乎与其他组分开(图3A)，并在整个研究过程中保持更高的FBG值和更大的离散度。Co和pA1c组之间(从第1周到第17周)、Co和Met和Met+pA1c组之间(从第2周到第17周)、Met和pA1c组之间(第12、16周、和17)以及Met和Met+pA1c组之间(第13周和15周)存在显著差异。同时，从第10周开始，Met组的FBG值不断增加，表明Met疗效随着时间的推移减弱。 所有研究组在研究开始时FBG水平相似(平均FBG 62.3±4.4 mg/dL，范围55.0-71.0 mg/dL)。然而，在研究结束时，观察到组间存在很大差异(图3B)。研究发现了与BW相似的趋势，即Co组的FBG明显高于其他研究组(160.6±37.2 mg/dL；与所有组相比p<0.001)。最重要的是，发现Met和pA1c组之间存在显著差异(Met组：102.6±5.4 mg/dL，pA1c组：72.0±11.0 mg/dL；p<0.05)。然而，就FBG而言，Met+pA1c组(84.3±13.4 mg/dL)与Met组和pA1c组的FBG值相当(图3B)。另一方面，14周时IPGTT的曲线下面积(AUC)反映了pA1c给药组和对照组之间葡萄糖耐量的显著差异(图3C、D)。 从图3E可以明显看出，益生菌干预导致胰岛素代谢发生变化，因为pA1c和Met+pA1c组在研究结束时都呈现出显著更高的血清C肽水平。然而，单独使用二甲双胍并没有改变研究结束时(17周)的C肽浓度。图3F显示，HOMA-IR评分主要受到益生菌补充剂的影响。与Co组相比，pA1c组和Met+pA1c组的HOMA-IR值显著降低(pA1c和Met+pA1c组分别为p<0.01和p<0.05)。然而，HOMA-β受到所有治疗的显著影响，在研究结束时，所有组之间的HOMA-β评分差异显著，特别是Co组(图3G)。其中，Co组最低值(2.2±0.5)，pA1c组最高(8.3±1.2)，其平均值约为对照组的3.6倍。 估计了胰岛素阳性面积与总胰腺面积的比率，没有发现组间的显著差异(图4A)。然而，当我们量化胰岛素+区域的强度(强度值：1、2或3)时发现了显著差异(图4B)。强度1和强度2区域的百分比在所有研究组中具有可比性。Met+pA1c组强度3区域的百分比最高，并且显著超过Co组的百分比(p<0.05)。代表性图像如图4C所示。

图4. (A)散点图表示各研究组胰岛素+区域的百分比和(B)胰岛素+区域的强度(每组n=8只小鼠)。(C) Co、Met、pA1c和Met+pA1c组胰岛素免疫染色胰腺切片的代表性图像(比例尺，50 µm)。*p<0.05。 

3所有治疗都保护小鼠免受高瘦素水平的影响，并引起脂质谱的显著变化

数据显示血清GLP-1浓度范围很广，范围为244.1至590.9 pg/mL。pA1c和Met+pA1c组的平均值分别最低和最高(396.1±109.7和498.8±125.0 pg/mL)。各组之间的GLP-1水平差异显著(p<0.05)(图5A)。 值得注意的是，血清瘦素的数据表明，二甲双胍、益生菌及其联合治疗对这种脂肪因子有深远的影响。如图5B所示，Co组达到了非常高的值(17.8±13.9 ng/mL)，远远超过其他组(Met、pA1c和Met+pA1c组分别为2.0±3.7、0.9±1.4和0.4±0.8 ng/mL)，组间差异显著(与Met和pA1c组p<0.01，与Met和Met+pA1c组相比p<0.001)。在其他生化参数方面，我们发现各组之间存在一定差异(表1)。与Co组相比，pA1c和Met+pA1c组小鼠的ALT值较低。相比之下，AST值没有发现显著差异。 另一方面，我们发现干预影响了一些血脂指标。与Co组相比，三种治疗均降低了TC和HDL。同时，只有Met和Met+pA1c治疗能够显著降低血清LDL水平。干预对血清TG有显著影响，组间差异显著。与TC和HDL类似，Met和Met+pA1c组的TG浓度低于Co组(p<0.001)。然而，pA1c组的TG水平明显高于Co组(p<0.001)。这是数据中得出的最引人注目的观察结果，因为与Met和Met+pA1c组相比，pA1c组的TG值异常高(p<0.01)。与对照组相比，只有Met+pA1c组的动物NEFAs水平降低(p<0.05)。与在TG中发现的结果相似，pA1c组的NEFA浓度最高，并且与Met和Met+pA1c组有显著差异(p<0.01)。

图5. 各组血清(A) GLP-1和(B)瘦素水平的散点图(每组n=8-9只小鼠)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

表1. 治疗后的生化参数。

4二甲双胍、pA1c及其联用对能量代谢和炎症相关基因有轻微影响

关于肝脏代谢相关基因的基因表达(图6A)，发现6个分析基因中有4个存在显著差异。二甲双胍治疗上调了参与脂肪生成的Fasn的mRNA表达。其相对表达量在Met组显著高于其他组(与Co和Met+pA1c组相比p<0.01；与pA1c组相比p<0.001)。Cpt1也发生了改变，Co和Met、Met和pA1c以及pA1c和Met+pA1c之间存在显著差异(所有比较p<0.05)。相比之下，Acox只在pA1c和Met+pA1c组之间存在显著差异(p<0.05)。Co和pA1c组之间Pparγ存在显著差异(p<0.05)。所有治疗均未改变肝脏中Pparα或Srebp的表达。 本研究还检测了与碳水化合物代谢相关的3个基因(图6B)。G6Pase在Met和Met+pA1c组中均下调(p<0.001)，而pA1c组与Co组相当，并且与两组相比(Met组和Met+pA1c组)有显著差异。关于Pepck和Gck，没有发现组间存在显著差异。单独使用二甲双胍的影响值得关注，因为Pepck和Gck在Met组中分别显示出更高和更低的趋势，并且表现不同于其他研究组。关于肝脏中的炎症标志物(图6C)，我们发现Met组有更高值的趋势；但是，各组之间没有显著差异。

图6. (A)脂质代谢、(B)碳水化合物代谢和(C)炎症相关基因的肝脏mRNA相对表达水平。Acox：乙酰辅酶A氧化酶；Cpt1：肉碱棕榈酰转移酶1；Fasn：脂肪酸合成酶；Gck：葡萄糖激酶；G6pase:葡萄糖-6-磷酸酶；IL-6：白细胞介素6；IL-1β：白细胞介素1β；Pepck：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；Pparα：过氧化物酶体增殖物激活受体α；Ppaγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ；Srebp:固醇调节元件结合蛋白。所有数据均表示为平均值±SD(每组n=6只小鼠)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

5pA1c及其与二甲双胍联用对HFD喂养小鼠的肝脂肪变性有保护作用

如图7A所示，肝脂肪变性分析显示，与Co组相比，pA1c和Met+pA1c组的脂肪变性百分比显著降低(p<0.05)，表明其对肝损伤具有保护作用。图7B中显示代表性图像。

图7. (A)治疗对肝脏脂质积累的影响，以组织学切片中脂滴的百分比表示(每组n=8只小鼠)。(B) H&E染色肝脏切片的代表性图像(比例尺，25 µm)。*p<0.05。

6二甲双胍及其与pA1c联用可维持分泌粘液的杯状细胞增殖，但不影响肠道中GLP-1的释放

小肠分析显示，两种二甲双胍治疗组的杯状细胞百分比显著增加。此外，Met组的百分比显著高于pA1c组(p<0.01)(图8A)。代表性图像如图8B所示。另一方面，治疗不影响肠细胞中GLP-1的产生，各组间GLP-1+细胞的百分比没有显著差异(图8C)；代表性图像如图8D所示。

图8. (A)代表肠组织中杯状细胞百分比的散点图和(B) PAS染色肠切片的代表性图像(每组n=8只小鼠)(比例尺，50 µm)。(C)代表GLP-1+细胞百分比的散点图，(D)肠切片GLP-1免疫染色的代表性图像(每组n=8只小鼠)(比例尺，100 µm)。**p<0.01；***p<0.001。

7二甲双胍、pA1c及其组合调节肠道菌群组成

总共有19个样本被纳入宏基因组分析(Co、Met和Met+pA1c组n=5，pA1c组n=4)。通过Simpson指数在物种水平上测定的肠道微生物群的α多样性在各组间存在显著差异(p<0.01)。有趣的是，与Co组相比，Met+pA1c组的α多样性显著降低(p<0.03)。此外，与单益生菌治疗(pA1c组)相比，单独接受二甲双胍(Met组)或联合治疗(Met+pA1c组)的组显示出显著较低的α多样性(分别为p<0.02和p<0.009)(图9A)。利用主坐标分析(PCoA)和Bray-Curtis距离对其β多样性进行了分析。统计学分析显示四组之间存在显著差异(PERMANOVA，p<0.001)。如图9B所示，pA1c组在组样本之间表现出最高的相似性，而其他三组样本的异质性更强。在属水平分析时，观察到的最显著变化是pA1c组中几乎没有乳杆菌( Lactobacillus)和阿克曼氏菌(Akkermansia)。相比之下，二甲双胍给药对这两个属有相反的效果，与pA1c组相比，这两个属显示出更高的相对丰度并且接近于Co组(图9C)。 为了分析丰度存在显著差异的分类群(在种、属和科水平)，在对照组和每个治疗组之间进行了Student’s t检验(Co vs. Met、Co vs. pA1c和Co vs. Met+pA1c)。图10以Venn图的形式显示了每个测试的结果，以比较上调(图10A)或下调(图10B)的分类群。结果表明，pA1c治疗后唯一常见的上调分类群(pA1c和Met+pA1c组)是Pediococcus lolii。在二甲双胍治疗组(Met和Met+pA1c)中共有四种类群上调，包括革兰氏阳性菌Faecalibacterium、Faecalibacterium praustnizii和Eubacterium coprostanoligenes以及革兰氏阴性菌Porphyromonas circumdentaria。引起粪便微生物群最显著变化的处理是Met+pA1c，其显著上调了53种微生物，包括11科、18属和24种。此外，一些分类群仅在单一益生菌或二甲双胍治疗时上调。pA1c组仅增加了3个分类群(Stomatobaculum longum、Stomatobaculum和Pectinatus)，Met组增加了4个分类群(Alistipes senegalensis、Bacteroide scaecimuris、Lactobacillus ruminis和Lactobacillus amylolyticus)(图10A)。 另一方面，与Co组相比，三组中下调的分类群的Venn图表明，pA1c和Met+pA1c组共有4种类群(Eubacterium biforme、Clostridiumcellulosi、Holdemanella和Faecalicoccus)，Met和Met+pA1c组共有25种类群，隶属2科6属17种。此外，有3个分类群(Pediococcus argentinicus、Lactobacillus johnsonii和Lactobacillus gasseri)仅存在于pA1c组中，18个分类群(5科6属7种)仅存在于Met组中。同样，在Met+pA1c组中发现了73种下调微生物类群，包括6科20属47种(图10B)。三组之间、Met和pA1c组之间均未发现共同的上调/下调分类群。 由于该研究旨在检查二甲双胍和pA1c给药的效果，因此特别注意了研究组中Pediococcus菌株的存在。结果发现在接受益生菌的组(pA1c和Met+pA1c组)中存在大量的Pediococcus lolii，该分类群在Co组中非常稀少，而在Met组中几乎不存在。有趣的是，这种情况在其他Pediococcus菌株中没有发现，应该注意的是，P. lolii被描述为P. acidilactici菌株，因为它们之间序列高度相似。

图9. 肠道菌群多样性的调节。(A) Simpson指数测定的物种水平α多样性。(B)使用基于主坐标分析(PCoA)的排序方法进行β多样性分析(PERMANOVA检验)。(C)最丰富的20个属的相对丰度(每组n=4-5只小鼠)。*p<0.05；**p<0.01。

图10. 所鉴定分类群的维恩图显示与Co组相比，Met、pA1c和Met+pA1c组中(A)上调和(B)下调的分类群(每组n=4-5只小鼠)。

讨论

一系列实验研究证明了不同Pediococcus菌株生物学特性的益处，包括耐消化、良好的益生菌特性，以及对病原微生物的拮抗作用。作者最近证实，Pediococcus acidilactici pA1c通过胰岛素信号通路抵消C. elegans高葡萄糖暴露的影响，及其在HFD诱导的T2D小鼠中发挥抗糖尿病作用。在本研究中，进一步评估了益生菌与二甲双胍(针对T2D的一线药物)联用的效果，以测试与当前的治疗相比，这种组合是否更具优势。本研究的结果表明，给药pA1c、二甲双胍及其联用对HFD喂养的小鼠具有降血糖作用，降低IR，增强胰腺功能。值得注意的是，pA1c和二甲双胍联用治疗效果最好。尽管如此，我们观察到每种治疗对小鼠的生理和基因表达都有不同的影响，二甲双胍和pA1c似乎可能通过不同的作用机制发挥其有益作用。 如上所述，三种治疗方法(pA1c、二甲双胍和两者联合)在研究期间显著降低了血糖，但显然，单独使用二甲双胍无法长期维持低FBG值，并且在研究结束时失去了降低血糖的能力。这些结果与之前在T2D小鼠模型中的结果形成对比，在T2D小鼠模型中，二甲双胍给药在6周、13周或6个月后有效降低了FBG。C肽和HOMA-IR与FBG观察结果一致，其中pA1c的摄入(单独或与二甲双胍联用)明显优于单用二甲双胍。

这两组动物表现出更好的β细胞功能，表明pA1c在我们的模型中发挥促胰岛素作用。此外，所有研究组都没有出现极低的FBG值，这是一个积极的结果，表明单独使用益生菌及其与二甲双胍联用都是安全的，并且它们不会给糖尿病患者带来低血糖风险。 值得注意的是，组织学分析暗示pA1c和二甲双胍联合使用对胰腺β细胞有更大的影响，因为接受这种治疗的动物对胰岛素表现出更强的免疫组织化学反应性，表明胰岛素产量更高。考虑到这一点，同时使用pA1c和二甲双胍对于胰腺内分泌功能较差的糖尿病患者具有特殊的意义。众所周知，GLP-1可以控制β细胞的大量增殖和活性，是治疗T2D的关键因素。我们之前的临床前研究和其他在T2D和HFD喂养小鼠模型中使用益生菌的动物实验显示血清GLP-1显著升高。一些作者讨论过二甲双胍可以通过增加GLP-1的释放直接提高GLP-1水平，或者通过降低二肽基肽酶4(DPP-4)活性间接提高GLP-1水平。在T2D受试者和HFD喂养小鼠中，二甲双胍给药增加了GLP-1水平。相反，在本研究中，血液或肠道组织中未发现GLP-1水平存在显著差异，即使在二甲双胍治疗组中也是如此。 先前有研究表明，二甲双胍治疗T2D患者可发挥降血糖作用，主要是通过抑制肝脏糖异生。我们观察到二甲双胍及其与pA1c联用治疗对肝脏G6Pase有显著影响，但对Pepck或Gck没有影响。然而，二甲双胍对肝脏G6Pase和Gck相对表达的影响仍然存在争议，动物研究报告二甲双胍治疗后G6Pase和Gck的表达增加或减少。 接下来，可以帮助我们阐明二甲双胍与pA1c联合作用的分子是瘦素，这是一种脂肪因子，可以作用于下丘脑并控制食物摄入。在本研究中，对照组和治疗组之间瘦素水平的巨大差异并未转化为食物摄入量的变化，但确实影响了BW，对照组动物的BW有所增加。这些结果与以前的研究结果一致，但与某些研究的结果相反，他们发现与未治疗组相比，二甲双胍给药对BW没有影响。Zulkawi等人报告了二甲双胍治疗后食物摄入量下降。尽管我们没有关于身体成分的数据，但血清瘦素结果强烈表明，与对照动物相比，这三种治疗(尤其是pA1c和二甲双胍联用)导致脂肪库减少。虽然白色脂肪细胞专门储存脂肪，但脂肪也会在非脂肪组织中堆积，形成异位脂质沉积。在IR条件下，肝脏脂肪从头合成(DNL)的激活可导致组织中甘油三酯液滴的积累，从而引起代谢应激并促进非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病。在这一项中，发现HOMA-IR值最高的组(Co组)也呈现出最高的Srebp水平以及最高的肝脂肪变性。SREBP是控制DNL和TG合成的重要转录因子，并且随着时间的推移，它的激活也会促进肝脏IR。尽管未发现显著差异，但可以观察到对照组肝脏Srebp mRNA水平升高的趋势，这与肝脂肪变性的结果非常吻合。

事实上，之前的一项动物研究报告了肝组织中Srebp和TG之间的显著相关性。然而，除DNL外，还有其他过程控制肝脏脂肪积累，例如脂肪酸氧化和循环脂质输入和输出，这使我们很难确定治疗如何影响肝脏脂质代谢和储存。 肝脏脂质积累的原因之一是脂肪组织中的脂肪酸动员。因此，我们期望在脂肪组织质量最高的人群中发现更多的脂肪变性。虽然尚未确定身体成分，但BW和瘦素的数据揭示了对照动物与接受二甲双胍、pA1c或两者联用治疗的动物之间的重要差异，这也可能表明脂肪沉积存在差异。在肝脏组织方面，二甲双胍抑制ob/ob小鼠HFD诱发的脂肪性肝病，并在临床试验中发现脂肪性肝病的发病率降低，而另一项针对T2D受试者的研究发现二甲双胍治疗后肝脏脂肪含量没有变化。 虽然Pparα未被二甲双胍改变，但Cpt1受到负面影响并且在单独使用益生菌治疗的组中保持不变。此外，另一种与脂肪酸氧化有关的基因Acox的行为方式似乎与Cpt1相似。所有这些可能表明二甲双胍影响脂肪酸分解代谢。 根据上述内容，本研究发现pA1c治疗组的肝脂肪变性较低，Fasn表达也较二甲双胍治疗组低，尽管DNL的主要转录调节因子Srebp在任何治疗中都没有显著变化。在先前的实验中，也发现秀丽隐杆线虫中Fasn被pA1c下调。在本研究中，Pparγ在pA1c组中也被下调。同时，二甲双胍组出现肝脂肪变性，Fasn急剧升高，它是参与DNL的关键限速酶，也是脂肪生成的标志物。相反，接受二甲双胍的两组患者的血清TG和NEFAS较低，并且当二甲双胍和pA1c联合给药时再次获得更好的结果。这些结果可能表明，pA1c可以抵消肝脂肪变性并减轻DNL，这可以通过增加脂质输出来解释，而二甲双胍可能影响脂质代谢，特别是通过抑制脂肪酸氧化和激活DNL。接受二甲双胍和pA1c治疗的组肝脏Fasn表达较低、脂肪变性程度较低、血清TG和NEFAS较低，这一事实很好地证明了这一点。 根据ALT水平，pA1c治疗组表现出较低的肝毒性，来自促炎标志物的数据也支持这样的假设，即摄入益生菌有助于减轻HFD诱导的肝脏炎症。有趣的是，虽然之前的研究报告了二甲双胍的抗炎特性，但在我们的研究结束时，单独接受二甲双胍的组倾向于更高的IL-6和IL-1β，并且其与pA1c联用成功使细胞因子的表达正常化。考虑到肝脂肪变性和肝损伤是进一步肝病的风险因素，这一结果具有重要意义，表明摄入pA1c可以为糖尿病患者提供一定的肝损伤保护作用，这可能是通过平行发生的代谢途径来抵消观察到的二甲双胍的长期有害作用。 据报道，二甲双胍有利于增加杯状细胞数量。杯状细胞是产生粘液和其他分子的特殊分泌细胞，与其他上皮细胞释放的抗菌和防御成分一起构成物理化学屏障，维持上皮的完整性，并有助于调节潜在病原体和未知物质的进入。在HFD下，氧化应激会使粘液产生失调并损害其保护功能。炎症会导致脂多糖内毒素血症，这与IR和T2D的发展有关。在本研究中，与益生菌治疗相比，二甲双胍(单独和与pA1c联合使用)对肠道组织学的影响更大，导致产生粘液的杯状细胞数量增加，这与之前发表的研究一致。例如，一项针对溃疡性结肠炎小鼠模型的研究表明，二甲双胍可以通过降低炎症强度和促进粘液产生来改善肠道健康，这种作用似乎部分由肠道微生物群介导。同样，对AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠和链脲佐菌素诱导的T2D小鼠进行的另一项研究得出结论，二甲双胍有助于减轻肠道炎症、保持结肠组织学和减少肿瘤细胞增殖，作者怀疑微生物群介导的作用也是如此。作者假设，紊乱的微生物群可能会阻止二甲双胍的有益作用，而益生菌的加入将有助于促进二甲双胍的有益作用。在这方面，之前的一项研究表明，使用二甲双胍引起的胃肠道症状可能是由于大肠杆菌的富集。因此，益生菌等针对微生物群的干预措施可以帮助恢复健康的微生物群并重建肠道稳态。事实上，之前的一项研究证实，二甲双胍与益生菌-Bifidobacterium bifidum G9-1(BBG9-1)联用可改善T2D受试者的胃肠道症状(腹泻和便秘评分)。综上所述，益生菌菌株和二甲双胍同时给药似乎比单一治疗提供更多益处。 作者从之前的研究中了解到，肠道微生物群是与疾病进展和严重程度相关的风险因素，并且所有形式的糖尿病都伴随着显著的微生物群改变。

同样，大量文献表明，二甲双胍可引起肠道微生物群组成的显著变化，甚至菌株水平，并且二甲双胍的有效性部分归因于微生物介导。我们对四个实验组的微生物群组成进行了深入分析，旨在确定与二甲双胍、pA1c或其组合相关的微生物群模式，并随后了解激发我们研究中观察到的生理效应的潜在机制。据报道，二甲双胍降低了HFD喂养小鼠的微生物群α-多样性，同一动物模型中的另一项研究发现对α-多样性没有显著影响，而一项开放标签临床试验发现α-多样性增加。研究之间的这种异质性表明二甲双胍对微生物群多样性的影响缺乏共识。在本研究中，二甲双胍在改善HFD喂养小鼠的微生物群多样性方面不如益生菌治疗有效，因为单独补充二甲双胍或与pA1c联合补充会导致整体细菌多样性降低，而对照组和pA1c组的细菌多样性均较高且具有可比性。先前的一项病例对照研究得出结论，α-多样性与指示T2D严重程度的参数呈负相关，表明高菌群多样性可以更好地控制代谢。 接下来，研究发现在微生物群样本中，尤其是pA1c组中，Pediococcus lolii是Pediococcus属中最丰富的物种。从以前的文献中得知，一些P. lolii菌株和P. acidilactici以高序列相似性聚类在一起，这表明P. lolii的数量与益生菌一致。这证实pA1c具有良好的益生菌特性，从而导致其存活和肠道定植。此外，它与二甲双胍联合使用也可以保持较高数量，表明这种特定的益生菌菌株对抗糖尿病药物具有良好的耐受性，它们可以一起使用。本研究中所观察到的Pediococcus spp.丰度和/或效应是否在益生菌摄入中断时保持，还有待证实。 pA1c治疗(单独或与二甲双胍联合使用)与三种分类群的下调有关，这些分类群在不同的病理条件下富集。Eubacterium biforme被发现在幽门螺杆菌感染儿童和患有代谢功能障碍相关脂肪肝病的成人中富集。此外，Holdemanella在肝纤维化患者中显著增多，而Faecalicoccus在克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症和类风湿性关节炎患者中更为丰富。 关于研究中发现的相对丰度，二甲双胍(单独或与pA1c联合使用)引起的Akkermansia增加与之前在HFD喂养小鼠、db/db小鼠和T2D受试者中的报道一致。这一结果对于T2D的治疗非常有趣，因为Akkermansia是一种众所周知的有益细菌，因其对肠道完整性的有利影响而被广泛研究，并且经常在T2D以及糖尿病前期等早期阶段减少。与Akkermansia相似，pA1c组Lactobacillus显著降低。有关乳杆菌属的信息尚不清楚，尽管发现该属在糖尿病患者中大量存在，但先前的研究结果指出了物种效应；因此，检查单个乳杆菌物种而不是总乳杆菌丰度会更合适。

此外，二甲双胍未能显著影响微生物群多样性；它实质上影响了其结构，并导致特定肠道微生物类群的选择性调节。在体外实验中，二甲双胍单独或与益生菌联合使用可显著上调产丁酸细菌(BPB) Faecalibacterium、Faecalibacterium prausnitzii和Eubacterium coprostanoligenes，以及产乙酸和丁酸的Porphyromonas circumdentaria。与Roseburia spp.和Eubacterium rectale一样，F. praustnizii是人类微生物群中主要的BPB。这种共生细菌与更好的代谢健康有关，在糖尿病前期、1型和2型糖尿病患者中被发现缺乏，而在葡萄糖耐量正常的个体中则更为丰富。在无菌小鼠中，它与粘液产生和杯状细胞增加有关，因此与更强的肠道屏障有关，这与我们在二甲双胍治疗后发现的杯状细胞增加一致。用传统发酵酿造中分离的P. acidilactici菌株治疗HFD喂养的高脂血症大鼠，E. coprostanoligenes显著增加，并且通过代谢胆固醇来减轻血脂异常的能力归因于该细菌。在牙周炎小鼠模型中，E. coprostanoligenes与血清HbA1c呈负相关，并且在另一项针对HFD喂养小鼠的实验中，该细菌也与较低的FBG和体重有关。 在二甲双胍治疗的25个常见下调分类群中，产生SCFA的Allobaculum受到特别关注。与我们的结果一致，该属也被发现在喂食HFD的小鼠中显著丰富集，并且还与禁食诱导脂肪因子(FIAF)呈正相关，FIAF是脂质代谢的关键介质。与本研究的结果相反，之前对Goto-Kakizaki大鼠和HFD喂养大鼠的研究发现，二甲双胍和小檗碱均增加了Allobaculum丰度，其他抗糖尿病药物和益生菌治疗也发现了同样的效果。 本研究的目标之一是评估同时给药二甲双胍和pA1c的适用性，微生物群分析证实，联合治疗引起的变化与单独使用二甲双胍或pA1c观察到的变化不同。在Met+pA1c组中改变的一长串分类群中，Parvibacter和Coriobacteriaceae的上调很有趣。前者在用益生元治疗后的HFD喂养小鼠中富集，提高了胰岛素敏感性并保护它们免受肝脂肪变性和血脂异常，而在给予菊粉的ob/ob小鼠中也发现了类似的结果。此外，这种细菌与低密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关。关于Coriobacteriaceae，最近的一份报告发现，与妊娠糖尿病患者相比，该细菌科和其他细菌科在炎症评分较低的受试者和健康受试者中显著丰富。另一份研究将Roux-en-Y胃旁路术对T2D患者的大部分有益作用归因于该细菌科。

关于Met+pA1c组中下调的分类群，我们想强调两个特定的分类群：Acetatifactor muris和Bilophila wadsworthia。Acetatifactor muris存在于肥胖小鼠的肠道中，并且发现它在接受二甲双胍治疗的T2D患者中上调。Bilophila wadsworthia产生一种有毒气体，该气体会引起肠道损伤，并且与特定无病原体小鼠的全身性炎症有关。最后，二甲双胍组中Enterorhabdus muris下调，而在Met+pA1c组中上调。尽管本研究的结果与之前的研究不一致，即二甲双胍显著增加了HFD喂养小鼠的Enterorhabdus丰度，但与之前的一项研究一致，即低聚木糖给药使该属的丰度正常化，而该属在糖尿病前期个体中异常丰富。

 文献中也有关于益生菌和二甲双胍联合使用的其他研究，包括小鼠模型和人类T2D研究。同样，其他研究在不同的临床背景下测试了这种组合，例如溃疡性结肠炎、结直肠癌、非酒精性脂肪性肝炎和多囊卵巢综合征。然而，这是第一项检查一种抗糖尿病药物二甲双胍与益生菌菌株pA1c之间相容性的研究。我们承认，在饮用水中给药二甲双胍无法控制每只小鼠的实际摄入剂量，并且存在局限性，如果我们像其他方法一样通过口服强饲法给药，则可能会产生不同的结果。此外，我们认为有限的样本量使我们无法在某些研究参数中发现显著差异。

未来的研究应该集中在不同剂量的二甲双胍上，以找到保持有益效果的最低剂量，从而降低与pA1c联合使用时发生不良事件的风险。根据之前的一项研究，二甲双胍的剂量非常重要，可以显著决定其有益或有害作用；因此，在未来的研究中应仔细确定二甲双胍的用量。最重要的是，需要更多的实验来阐明pA1c背后的药代动力学，还需要进一步的研究来确定长期接触益生菌及其与二甲双胍联合使用的影响。  

结论

本研究是第一项联合二甲双胍和Pediococcus acidilactici菌株的研究，报告称联合治疗有助于缓解高血糖症。二甲双胍和pA1c的有益作用似乎是独立的；然而，鉴于血糖没有急剧下降，作者认为这两种机制之间可能存在某种交流或相互作用，从而防止低血糖。pA1c通过控制脂肪组织有助于改善身体成分，并通过影响肠道生理和共生微生物群来防止代谢失衡。因此，需要更多的实验来阐明这一问题。本研究的结果表明益生菌微生物预防或减轻T2D的有效性，并且支持pA1c是一种合适的抗糖尿病治疗方法的假设，它可以与二甲双胍联合使用以改善T2D，并最终减少二甲双胍治疗所需的剂量。

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