不是基因、不是肿标，这个检验医学研究肿瘤的新思路，值得关注

文章刊载于《临床实验室》杂志2023年6月刊“恶性肿瘤实验室检测”专题-「专家论坛」版块  页码p74-p80

作者：王希君 谭琴 马洁  

单位：北京医院生物治疗中心/国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院 

人类微生物组是一个复杂的生态系统，在身体的各个部位与宿主共生互动，宿主-微生物组的相互作用影响着多种生理、病理过程。已经发现在许多癌症类型中都存在瘤内微生物，瘤内微生物组与肿瘤之间存在着密切的联系，影响着肿瘤的发生、进展、转移和治疗反应。本文就瘤内微生物群的异质性、作用机制及靶向瘤内菌群的策略进行讨论，以期为瘤内微生物作为肿瘤诊断、治疗和预后的潜在生物标志物提供理论依据。

01 瘤内微生物概述  

人体中存在着丰富的微生物群，其中肠道中约有3.8 ×1013种微生物，重量接近1.8 kg。另外，在皮肤、口腔、呼吸道和生殖道在内的身体大部分黏膜区域也寄生着大量的微生物。这些微生物参与许多重要的生理过程，包括机体的新陈代谢和免疫调节等。正常情况下，宿主和共生微生物处于一个平衡的状态，两者相互适应、互利共生。但在某些病理情况下这种平衡会被打破，导致微生物生态学的改变。微生物菌群失调与机体多种疾病有关，如慢性炎症、糖尿病、肥胖甚至是癌症。

随着高通量测序和宏基因组学等研究技术的不断开发和应用，人们也发现微生物菌群和肿瘤发生之间存在着复杂的关系。恶性肿瘤组织是一种复杂的生态系统，除了肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等成分外，存在于肿瘤细胞之中独特的微生物群也是肿瘤微环境的一个重要组成部分。作为肿瘤微环境中调节肿瘤进展和影响预后的关键参与者，微生物群越来越受到关注，不同身体部位的微生物群落在各种肿瘤的发生和进展中发挥不同作用。目前，已有11种微生物被国际癌症登记处确认为“致癌微生物”。研究发现微生物与～15%的人类恶性肿瘤密切相关，共生细菌可以直接影响肿瘤的发生、进展及对治疗的反应。本文通过概述肿瘤组织中微生物群的异质性，瘤内微生物群在癌症发生发展和治疗中的功能和作用机制，理解瘤内微生物在肿瘤中的作用，解析微生物、肿瘤微环境和癌细胞之间的复杂关系，可为癌症的治疗、预后判断带来新的见解。

02 瘤内微生物群的异质性  

由于肿瘤内的微生物可能存在多种来源，提示不同癌症类型的微生物组是多样的，这一点在Ravid Straussman团队对微生物组的大规模研究中得到了证实。他们对七种癌症类型的1500多例肿瘤样本和邻近正常组织进行分析，确定了肿瘤类型的特定微生物组，每种肿瘤都有不同的微生物组组成。

胃肠道癌症受微生物群的影响非常大。最近一项研究分析了四种胃肠道癌症的瘤内微生物组成，该研究发现胃肠道肿瘤组织中拟杆菌、厚壁菌、变形菌、梭杆菌和放线菌是门水平上最丰富的分类群。此外，这些癌症中的细菌组成与正常组织中的细菌组成明显不同。由于肠道中存在大量的细菌，结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）与肠道微生物密切相关，为了解微生物组如何参与CRC的发展，已经对CRC患者的粘膜相关细菌或粪便微生物组进行了研究。其中，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, Fn）在结直肠癌中的作用已经相对明确，它可以促进CRC的发生、进展及耐药，可作为CRC患者预后不良的标志物。Liu等的研究发现，腺瘤患者粘膜上的细菌与没有腺瘤的患者相比，其多样性有所增加。一些肿瘤相关的细菌如梭杆菌、拟杆菌、微单胞菌和普雷沃氏菌的丰度在结直肠癌的不同阶段是可变的，表明微生物群的改变对CRC进展的影响。也有研究显示大肠杆菌定植于肿瘤中，可能通过破坏肠道血管屏障和促进转移前生态位的形成从而促进CRC肝转移。此外，脆弱拟杆菌可以招募其他细菌到结直肠癌部位并诱发炎症反应来促进肿瘤进展。

微生物群在胰腺癌中的存在已被多项研究证实。Geller等发现76%的人类胰腺导管腺癌样本中细菌检测是阳性的，其中γ-变形菌丰度最高。此外，研究表明阿氏肠杆菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、梭杆菌等也是胰腺癌丰度比较高的菌群。Tan等发现牙卟啉单胞菌同时存在于胰腺癌患者的口腔及肿瘤组织中，其通过诱导炎症性免疫微环境促进肿瘤的进展。一些瘤内微生物，如假黄单胞菌和链霉菌，可能与胰腺癌患者更长的生存期有关，提示瘤内微生物在胰腺癌的进展中发挥着复杂作用。 乳腺癌是女性发病率最高的癌症，虽然乳房并不是一个粘膜器官，但已经证明乳房组织中存在大量的微生物。Ravid Straussman团队对包括乳腺癌在内的7种肿瘤类型的癌症进行肿瘤微生物群分析，发现乳腺癌肿瘤中表现出最高的多样性。与正常组织相比，乳腺肿瘤组织表现出明显不同的微生物群组成。Tzeng等比较了健康人的乳腺组织、乳腺癌及癌旁正常组织的微生物群，该研究发现假单胞菌、卟啉单胞菌、变形杆菌和氮单胞菌属在肿瘤组织中丰度很高，而正常组织中的一些主要属，如丙酸杆菌和葡萄球菌在肿瘤组织中几乎未检测到，表明这些微生物可能起保护作用。Parhi等的研究表明Fn通过Fap2和Gal-GalNAc的组合定植于乳腺癌组织中，促进肿瘤的生长和转移。此外，肠毒性的脆弱拟杆菌也被发现定植于乳腺肿瘤。Parida等揭示肠毒性脆弱杆菌通过分泌脆弱杆菌毒素（Bacteroides fragilis toxin, BFT）诱导乳腺癌的发展，BFT通过激活下游β-catenin和Notch1轴发挥作用。Fu等研究发现乳腺肿瘤中存在葡萄球菌、乳酸菌、肠球菌和链球菌等多种兼性厌氧细菌，这些细菌存在于细胞质中，调节RhoA-ROCK通路重塑细胞骨架，具有保护肿瘤细胞抵抗血液压力等损伤，促进肿瘤细胞的转移的作用。

03 瘤内微生物群影响肿瘤发生、进展的作用机制  

瘤内微生物通过多种机制在肿瘤发生、进展和癌症治疗中发挥重要作用。在肿瘤发生过程中，一些微生物可能直接造成DNA损伤，导致肿瘤的形成和发展。也有研究表明，一些微生物会诱发促炎症反应和其他致癌相关信号通路的激活。肿瘤内的微生物也可以通过诱导免疫抑制来促进肿瘤的进展，并能以多种方式影响癌症的治疗。

在一些致癌细菌能以各种方式损害宿主DNA，引起基因突变，导致肿瘤的发生。在几种类型癌症中，尤其是消化道癌症，微生物群是造成DNA损伤的重要原因。肠杆菌科的一些成员会产生大肠杆菌素，导致DNA损伤并诱导肿瘤发生。Pleguezuelos-Manzano等的研究进一步证明了大肠杆菌素的诱变能力，它与致病岛pks密切相关。另一种诱导DNA损伤的细菌是肠毒性脆弱拟杆菌，它也可以产生毒素诱导DNA损伤。对家族性腺瘤病患者的肠粘膜分析表明，大肠杆菌和脆弱拟杆菌菌富集，它们共同定植于上皮细胞，并产生白细胞介素-17（Interlukin-17，IL-17），导致上皮细胞中大量DNA损伤。

激活促癌信号通路是瘤内微生物促进肿瘤进展的又一重要因素。研究人员发现，某些瘤内微生物会影响细胞因子的产生和分泌，如IL-6和肿瘤坏死因子-𝛼（Tumor necrosis factor 𝛼，TNF- 𝛼），诱发促炎症反应，通过激活NF-𝜅B途径或STAT3途径促进肿瘤的发展。此外，Toll样受体（Toll like receptor，TLR）的一些成员，如TLR4和TLR5，与肿瘤和微生物（包括肠道和瘤内微生物）之间的相互作用密切相关。2017年的一项研究表明，Fn活化TLR4信号通路，影响某些microRNA的水平，调节自噬，最终导致对化疗的抵抗。Wnt/β-catenin信号通路是一个重要的促癌通路，已经证明许多种类的微生物会激活这一途径，并通过直接激活β-catenin或激活E-cadherin来诱导肿瘤发生。例如，幽门螺杆菌产生的CagA直接注入宿主细胞的细胞质中，激活β-catenin信号，推动胃癌的发生。Fn表面表达的粘附分子FadA与宿主细胞上的E-cadherin结合。而脆弱杆菌产生的BFT也能刺激E-cadherin裂解，从而激活β-catenin。

瘤内微生物也会影响肿瘤的免疫微环境，从而影响肿瘤的进展和疗效。检查点抑制剂作为最热门的抗肿瘤策略之一，肿瘤内的微生物可能影响检查点蛋白并影响免疫微环境。研究表明，Fn表达的Fap2直接与检查点蛋白TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain）结合，并抑制NK细胞（Natural killer cell）以及T细胞的抗肿瘤活性。瘤内微生物还可以影响免疫抑制细胞的招募，Fn已被证明可以促进骨髓源性抑制细胞的招募。Jin等人报告了由瘤内微生物群诱导的与肺癌有关的免疫反应，该研究表明癌组织中的细菌通过激活IL-1和IL-23的表达，诱导了𝛾T细胞的扩张。𝛾𝛿T细胞通过释放IL- 17和IL-22促进肿瘤进展。另外，也有研究表明清除瘤内细菌促进M1样巨噬细胞和Th1细胞的分化，表明清除肿瘤内的细菌有助于逆转细菌引起的免疫抑制性微环境。另外，也有研究发现某些细菌的存在可能会促进抗肿瘤免疫或提高免疫治疗的疗效。如Gao等人发现肿瘤中存在的Fn通过激活STING （Stimulator of interferon genes）信号通路诱导肿瘤细胞PD-L1（Programmed cell death-ligand 1）表达上调，促进了PD-L1单抗的疗效，表明瘤内微生物群可能在肿瘤发生、进展中发挥着复杂的作用。

04 瘤内微生物菌群影响抗肿瘤治疗的效果  

瘤内微生物影响肿瘤化疗耐药的潜在机制主要通过以下两种途径：1）激活耐药相关的信号通路，如促进肿瘤细胞自噬；2）通过将药物代谢为非活性形式来影响化疗的效果。在结直肠癌患者中，瘤内细菌Fn也被证明在治疗过程中通过激活先天免疫系统和诱导自噬，促进奥沙利铂耐药性的发生。Geller等报告了吉西他滨（用于胰腺癌化疗的重要药物）可以被代谢成2',2'-二氟脱氧尿苷，从而失去其疗效。作者还发现，肿瘤内微生物（主要是γ-变形菌）表达的胞苷脱氨酶，可以完全代谢吉西他滨，从而增强耐药性。以上研究提醒我们需要更多地了解瘤内微生物的代谢作用，这可用于开发治疗癌症的具体策略。

化疗耐药的发生与肿瘤微生物群之间的关系已被广泛报道，但对放疗的研究仍然较少。放疗后，肠道微生物组失调的特点是共生双歧杆菌、粪便杆菌和梭杆菌的丰度降低，而拟杆菌和肠球菌的丰度增加。2021年，中国医学科学院和北京协和医学院研究者在 Cell Reports上发表了一篇研究，表明口腔微生物组与肠道微生物组协同作用影响结直肠癌放疗的疗效和预后，口腔微生物群的改变影响原发性直肠癌和结直肠癌肝转移瘤放射治疗的疗效和预后，口腔Fn迁移到CRC位点并损害放射治疗的疗效和预后。通过甲硝唑（metronidazole, MTI）处理可以消除口腔微生物改变引起的CRC放疗不良影响，口腔微生物群也通过肠道微生物与辐射引起的肠道损伤有关。

瘤内微生物除了影响化疗和放疗，对免疫治疗也有一定的影响。2015年，两项研究显示，包括双歧杆菌在内的共生肠道微生物组能够增强PD-L1检查点阻断的抗肿瘤疗效，同样也有研究证明Fn会增强结直肠癌患者的PD-L1单抗治疗效果。而多形拟杆菌和脆弱拟杆菌与增强CTLA-4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4）抑制剂的疗效有关。此外，PD-1/L1靶向疗法的抗肿瘤疗效与多种细菌有关，包括阿克曼氏菌、法氏菌、梭杆菌和双歧杆菌属。在用合理选择的干扰素诱导细菌菌株定植的无菌小鼠中，免疫检查点抑制剂的疗效和抗肿瘤T细胞反应明显增强，这与微生物代谢产物（丁酸盐、丙酸盐）有关。然而，这个作用在某些情况下仍然是相互矛盾的，丁酸盐也可能限制树突状细胞诱导肿瘤特异性T细胞和记忆T细胞的能力，从而抑制抗CTLA-4免疫检查点抑制剂的疗效。

05 以瘤内微生物菌群为靶向的癌症治疗策略  

随着对瘤内微生物的来源和相关作用机制的深入理解，瘤内微生物群不仅为癌症治疗提供了策略，还可以作为癌症治疗的目标。以瘤内微生物为靶向的癌症治疗方法主要包括以下4种策略：（1）粪便微生物组移植（fecal microbiota transplant, FMT）；（2）益生菌；（3）抗生素的使用；（4）纳米抗菌材料。目前，部分药物已经进入了临床试验阶段。

通过粪便微生物组移植将与疾病相关的微生物组替换为健康的配置，对治疗复发性梭状芽孢杆菌感染非常有效，也可能对某些溃疡性结肠炎的病例非常有效。芦荟乳杆菌被证明能与幽门螺杆菌竞争性地共同聚集，补充芦荟乳杆菌可以显著降低幽门螺杆菌的丰度，这表明高度针对性的细菌补充剂可能对癌症预防有效。乳酸菌和双歧杆菌被认为可以减少小鼠偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠CRC模型的肿瘤发病率、进展和体积。Bullman等人用MTI治疗Fn富集的患者源性异种移植模型时，明显减少了肿瘤中细菌的浸润程度，导致肿瘤细胞增殖受到抑制，肿瘤生长缓慢。Fu等人尝试将不同类型的抗生素和注射方法结合起来，最终实现了靶向清除瘤内细菌的目的，显著抑制了乳腺癌肺转移。但是，使用大剂量的抗生素来针对瘤内微生物可能会诱发严重的不良反应，如增加患炎症性肠病、神经系统疾病、肥胖和自身免疫性疾病的风险。已有研究证明癌症患者使用抗生素会导致肠道微生物群的抑制，从而导致抗肿瘤免疫反应的减弱。

在研究中利用EPR效应来靶向癌细胞并避免对身体其他组织的毒性，已被应用为纳米肿瘤学的基本原则，这个概念也被很多研究者用来针对瘤内微生物。Zhang等研究通过静电作用将特异性识别Fn的M13噬菌体与银纳米颗粒自组装，得到纳米颗粒负载的噬菌体（M13@Ag），这些噬菌体在有细菌浸润的肿瘤部位富集，并通过杀死肿瘤中的Fn阻止了抑制性免疫细胞的招募。本课题组近期发表的一项研究，设计了一种同时针对瘤内细菌和肿瘤细胞的两亲性纳米颗粒（Metronidazole−Fluorouridine，MTI-FDU），利用纳米粒子的EPR效应（Enhanced permeability and retention effect）MTI-FDU在肿瘤部位聚集，进入肿瘤部位后响应谷胱甘肽二硫键断裂，MTI和FDU分别杀死瘤内菌群和肿瘤细胞。此外，在靶向清除瘤内菌群的同时，纳米粒子对肠道菌群的作用也显著减小，证明其优越的适用性。

06 小结  

瘤内微生物群在调节肿瘤进展和疗效方面发挥着重要作用，合理利用微生物群可作为一种新的治疗策略，对癌症进行诊断和预后评估，并作为癌症治疗的潜在治疗目标。考虑到瘤内微生物的多源性特征，将瘤内微生物群的组成与体内其他部位的微生物群进行比较，可能有助于我们识别不同肿瘤中存在的关键微生物，为癌症预防提供新的见解。然而，目前的研究还没有完全澄清瘤内微生物的具体变化是癌症发展的原因还是结果，或者这些变化是否与癌症无关。瘤内微生物和宿主肿瘤之间的关系是复杂和不明确的，需要更多的研究来了解其机制。

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