精准前沿丨结直肠癌数字化图像的定量病理分析可改善无复发生存期的预测

本期《精准前沿》栏目分享匹兹堡医学中心研究团队发表于Gastroenterology（IF=29.4）上的一篇研究[1]，研究开发了一种定量分割算法（QuantCRC），用于识别结直肠癌（CRC）中与形态特征相关的感兴趣区域和物体，同时将QuantCRC应用于来自多个中心的大型CRC队列，以测试QuantCRC量化特征与分子改变和病理学家获得的组织学特征之间的关联，并评估QuantCRC作为预后生物标志物的潜力。

研究背景

结直肠癌（CRC）在形态上具有多样性，当前的病理评估无法以定量方式捕捉到这种变异性。这种形态变异性包含了可以识别具有不同预后和潜在分子改变的亚型的重要线索。例如，等级、黏液形态、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和错配修复缺陷（MMRD）之间存在着众所周知的关联。静脉、淋巴和神经周围的浸润是用于指导治疗的其他众所周知的特征，特别是在淋巴结阴性的CRC中。最近，肿瘤出芽（TB）和低分化簇（PDC）被认识为上皮间质转化和不良预后的标志物。最后，富含基质的肿瘤和具有不成熟的纤维性基质的肿瘤与较差的预后有关。  

由于计算机视觉的最新进展，已经使用数字化的hematoxylin和eosin（H＆E）染片开发了基于图像的生物标志物，这些标志物可以预测CRC的结果或特定的分子改变，如MMR状态、KRAS/BRAF突变和共识分子亚型。尽管这些算法很有用，但它们仅经过训练可以识别特定的分子改变或结果，并且不提供用于分类这些肿瘤的特征的详细信息。鉴于CRC组织学解释日益复杂且难以量化各种特征，作者有必要开发工具来辅助病理学家，并帮助指导治疗和预测结果。这些工具可以帮助标准化CRC的报告，并减少观察者之间的变异性。

研究设计

作者开发了一种定量分割算法（QuantCRC），用于识别结直肠癌（CRC）中与形态特征相关的感兴趣区域和物体， 同时量化基质和基质亚型（不成熟、炎症和成熟）、肿瘤和肿瘤等级、印戒细胞癌（SRCC）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、肿瘤出芽和低分化簇（作为一个组合特征）、坏死和黏液的数量。对于病理学家来说，手动精确地量化这些特征是不可能的。定量分割算法（QuantCRC）被应用于6468张数字化的hematoxylin和eosin染片的CRC图像上。每张图像记录了上述15个参数，并测试其与临床病理特征和分子改变之间的关联。利用来自内部队列（n=1928）的数据开发了一个预测无复发生存率的预后模型，并在内部测试（n=483）和外部队列（n=938）上进行了验证。

图1. workflow设计

研究人群包括来自结直肠癌家族登记处（CCFR），以及CCFR之外的3个机构的CRC患者：匹兹堡医学中心（UPMC）、多伦多山西奈医院（Mount Sinai Hospital Toronto）和西雅图-普吉特声癌症登记处（Seattle-Puget Sound Cancer Registry）。CCFR在CRC诊断后招募参与者，并进行了详细描述的前瞻性随访。UPMC和Mount Sinai的队列分别包括2010年至2015年和2011年至2016年期间这些机构连续切除的CRC患者。西雅图-普吉特声癌症登记处队列包括2016年至2018年间20至74岁被诊断为CRC的患者。通过医疗记录的审查评估了3349例I-III期CRC的复发情况，其中的患者的中位随访时间为58个月。

对于UPMC和Mount Sinai队列，一位在TB评估方面具有专业知识的病理学家报道了TB的级别，分为Bd1（每0.785 mm2 0–4个）、Bd2（每0.785 mm2 5–9个）和Bd3（每0.785 mm2 10个及以上）。对UPMC队列的一个子集进行了CD8免疫组织化学检测（clone CD8/144B；DAKO，Carpinteria，CA），使用Aperio nuclear v9算法计数CD8阳性细胞。根据研究表明，在肿瘤边缘每平方毫米大于等于182个，或者在肿瘤中心每平方毫米大于等于129个与生存有关，因此，肿瘤被分为低水平（两个位置上都低于阈值）和高水平（至少一个位置高于阈值）。

通过聚合酶链反应（PCR）和/或MMR蛋白免疫组织化学进行MMR状态的测试。对于通过PCR评估的CCFR肿瘤，如果有30%以上的标记显示不稳定性，则将肿瘤分类为MMR缺陷（MMRD），如果0%至29%的标记显示不稳定性，则将其分类为MMR正常（MMRP）。UPMC、Mount Sinai和Seattle-Puget队列使用MMR免疫组织化学。如果在所有肿瘤细胞中，MLH1、MSH2、MSH6和/或PMS2的表达丧失，并且经过适当的内部对照，肿瘤被分类为MMRD。

CCFR和UPMC队列都通过荧光等位基因特异PCR检测BRAF c.1799T>A（p.V600E）突变。Mount Sinai和Seattle-Puget Sound队列没有可用的KRAS和BRAF数据。一部分CCFR肿瘤的CpG岛甲基化（CIMP）数据是使用MethyLight方法获得的，如果有3个或以上的标记甲基化，被归类为CIMP阳性；如果有2个或更少的标记甲基化，则被归类为非CIMP。

研究结果

1. 定量分割算法QuantCRC

本研究要求患有结直肠癌（CRC）且已经进行手术切除，并且有可数字化的H&E玻片，才能纳入研究中，这导致有7053例潜在的CRC可用于分析。参与者的性别不作为纳入或排除的标准。每例手术切除的CRC中选取一张代表性的H&E玻片，使用Leica Aperio GT450或AT2在40倍放大率下进行数字化。排除了经过新辅助治疗的直肠癌（n=425）和H&E染色、组织切片或图像质量较差的图像（n=160），最终得到6468例队列（图2）。

图2. 描述了本研究使用的队列以及每个中心数字化的玻片数量的流程图

所有图像都上传至Aiforia Create深度学习云平台（Ai foria Technologies, Helsinki, Finland），这是一个专门用于组织学图像的商业可用平台。每个图像都经过胃肠病理学家（Rish K. Pai）的手动审核，并绘制出整个肿瘤区域（每个CRC平均分析面积为96.5平方毫米）。采用了一种深度学习量化分割算法QuantCRC，对肿瘤区域进行图像分割（图3），具体描述见先前的说明。简而言之，当前的QuantCRC版本是根据559个CRC图像上进行的24,157个注释进行训练的。

该分割算法使用卷积神经网络以逐步的方式对图像进行分割。首先，将肿瘤区域分割为癌肉瘤组织、TB/PDC（肿瘤出芽/低分化簇）、间质、粘液、坏死组织、脂肪和平滑肌等部分。第二层将间质分割为不成熟型（松驰的、常常是黏液质的间质，内有不规则排列的肥胖成纤维细胞和胶原纤维）、成熟型（密集的胶原区域，有稀疏分散的成纤维细胞，常常伴有平行的胶原纤维）和炎症型（混杂着慢性炎症细胞聚集，损伤间质细胞的密集区域）亚型。第三层将癌肉瘤组织分割为低级别、高级别和印戒细胞癌亚型。第四层用于识别肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。

针对每个图像，从组织区域中减去脂肪和平滑肌，以生成肿瘤区域。从肿瘤区域中，记录以下15个参数：肿瘤百分比，间质百分比，肿瘤与间质的比率，肿瘤内TB/PDC的百分比，肿瘤内粘液的百分比，肿瘤床内坏死组织的百分比，高级别癌肉瘤组织比例，印戒细胞癌比例，每平方毫米肿瘤中的TILs数量，不成熟型间质（肿瘤床）百分比，炎症型间质（肿瘤床）百分比，成熟型间质（肿瘤床）百分比，不成熟型（间质区域）百分比，炎症型（间质区域）百分比，以及成熟型（间质区域）百分比。这15个定量参数构成了用于下游分析的QuantCRC特征。

图3.QuantCRC的结构以及量化的特征种类展示

2. QuantCRC与肿瘤分期、肿瘤位置和组织学特征显著相关

在根据TNM分期、肿瘤位置、组织学分类、肿瘤分级、静脉/淋巴/神经浸润（VELIPI）和病理学评估的TB分级对QuantCRC结果进行分层时，发现显著差异（表1）。肿瘤分期增加或存在VELIPI与肿瘤：间质比、%炎症型间质（肿瘤床和间质区域）、每平方毫米肿瘤中的TILs数量、%TB/PDC、%高级别癌组织、%不成熟型间质（肿瘤床和间质区域）、%成熟型间质（肿瘤床和间质区域）呈相关关系。此外，随着病理学评估中TB分级的增加，%TB/PDC和%不成熟型间质（肿瘤床和间质区域）也增加。随着TB分级的增加，%炎症型间质（肿瘤床和间质区域）和每平方毫米肿瘤中的TILs数量减少。这些结果表明，富含间质、主要由不成熟型间质形态和较低免疫细胞浸润（间质和肿瘤内）的肿瘤更可能具有不利的组织学特征。

根据QuantCRC的结果，发现在肿瘤分级（低级别 vs 高级别，%高级别 10.3 vs 32.9, P < 0.001）、粘液含量（NOS腺癌 vs 粘液性癌，%粘液 1.3 vs 52.9, P < 0.001）和印戒细胞癌（NOS腺癌 vs 印戒细胞癌，%印戒细胞癌 0.0 vs 38.9, P < 0.001）方面存在差异（见表1和附表6）。与常规腺癌相比，髓样癌与高级别形态学、炎症型间质和增加的TILs相关。根据肿瘤位置，QuantCRC的结果也有所不同，近端肿瘤与肿瘤：间质比、%粘液、%高级别、%炎症型间质和TILs相比远端肿瘤表现出更高的值。

表1. 肿瘤阶段、肿瘤位置、形态学特征与QuantCRC结果的关联

3. QuantCRC特征与分子突变信息

在根据分子突变进行分层时，QuantCRC的特征显示出显著差异（表2）。MMRD肿瘤表现出更高的肿瘤：间质比，较低的%TB/PDC，较高的%粘液，较高的%高级别肿瘤，较低的不成熟型间质（肿瘤床和间质区域），较高的炎症型间质（肿瘤床和间质区域），较低的成熟型间质（肿瘤床和间质区域），以及较高的每平方毫米肿瘤中的TILs数量，与MMRP肿瘤相比。其中，TILs的差异尤为显著（MMRP vs MMRD，26.8 vs 64.0，P<0.001）。

在MMRP组中，存在KRAS或BRAF突变与增加的%粘液占比相关。MMRP BRAF突变的肿瘤具有最高的%TB/PDC和%高级别。在MMRD组中，KRAS和BRAF突变也与增加的%粘液占比相关。与KRAS/BRAF野生型的MMRD CRC相比，KRAS和BRAF突变的MMRD肿瘤具有更高的肿瘤：间质比和每平方毫米肿瘤中的TILs数量。MMRD BRAF突变的肿瘤具有最高的%高级别肿瘤。最后，在MMRP和MMRD组中，CIMP阳性肿瘤显示出更高的%TB/PDC和%高级别肿瘤。在MMRP组中，CIMP阳性肿瘤显示出更高的%粘液占比。在MMRD组中，CIMP阳性肿瘤显示出更多的TILs数量。

表2. 分子突变与QuantCRC结果的关联

4. QuantCRC与无复发生存期（RFS）

根据来自I-III期肿瘤的结果，将QuantCRC的数据分为含有相等组的四分位数。当按照%TB/PDC、%肿瘤、%间质、肿瘤:间质比、每平方毫米肿瘤中的TILs数量、%不成熟型间质（肿瘤床）、%炎症型间质（肿瘤床）和%成熟型间质（肿瘤床）进行分层时，RFS存在显著差异（图4）。当以肿瘤床内百分比（图4）或间质区域内百分比来衡量时，间质亚型与RFS相关。

图4. 根据QuantCRC特征的四分位数，使用Kaplan-Meier分析对I-III期CRC的RFS进行了研究

5. QuantCRC在预后模型中的价值

使用Cox比例风险模型基于阶段、MMR状况和QuantCRC进行了RFS的预测训练。模型中的变量仅限于那些对于切除的CRC而言易于获取且不受病理医师观察者间变异的影响。阶段可以从病理报告和病历中获取，QuantCRC仅需要肿瘤的数字化H&E切片。由于普遍采用普查筛查，MMR状况对于CRC现在是容易获取的。模型训练使用80%的具有复发数据的I-III期CCFR队列（n=1928）进行，在CCFR肿瘤中保留了20%作为内部测试队列（n=483）。非CCFR肿瘤（UPMC、Mount Sinai和Seattle-Puget，n=938）用于外部验证队列。

完整模型在内部测试队列和外部验证队列中的c-index分别为0.714（95% CI，0.702–0.724）和0.744（95% CI，0.741–0.754）。从模型中排除QuantCRC后，内部测试队列的c-index降低了0.036至0.678（95% CI，0.675–0.688），外部验证队列降低了0.065至0.679（95% CI，0.673–0.694）。这与将阶段从模型中排除时c-index的降低类似，分别降低了0.034至0.680（95% CI，0.679–0.689）和0.053至0.691（95% CI，0.682–0.696），对应于内部测试队列和外部验证队列。MMR对模型性能的贡献较小，因为在内部测试（0.703，95% CI，0.701–0.707）和外部验证（0.739，95% CI，0.738–0.748）队列中，只是略微降低了c-index。总体而言，这些分析表明QuantCRC在完整预测模型中发挥了重要作用。

为了生成临床上有用的预后工具，确定了训练、内部测试和外部验证队列中I、II和III期CRC的2个月间隔内的RFS预测概率。在训练队列中，III期肿瘤36个月RFS预测概率的频率分布如图5A所示。为了确定风险组，将36个月预测的RFS结果低于第33个百分位数的肿瘤视为高风险，介于第34个到第65个百分位数之间的为中等风险，高于第66个百分位数的为低风险。将这些截断应用于内部测试和外部验证队列中的36个月预测RFS结果，并通过Kaplan-Meier分析评估RFS的差异 (图5B和C)。在内部测试和外部验证队列中，这些风险组在RFS方面显示出显著差异 (在外部验证队列中，低风险组与高风险组的风险比为2.72，95% CI为1.62-4.89，P=0.0002)。图5D显示了外部验证队列中根据风险组分类的QuantCRC特征。除了粘液百分比（%mucin）、印戒细胞癌百分比（%SRCC）、坏死百分比（%necrosis）和成熟间质百分比（stromal region）之外，QuantCRC特征在风险组之间显示出显著差异。

图5. 使用预后模型对III期肿瘤风险组进行分类

在训练队列中，显示了II期肿瘤36个月RFS预测概率的频率分布，如图6A所示。使用第33个和第66个百分位数来确定高、中、低风险肿瘤。当这些截断值应用于内部测试和外部验证队列中的II期肿瘤时，发现了RFS的显著差异（在外部验证队列中低风险组与高风险组的风险比为3.18，95% CI为1.51-6.73，P=0.002）（图6B和C）。在II期风险组中发现了QuantCRC特征的显著差异，除了坏死百分比（%necrosis）、成熟间质百分比（肿瘤床）和成熟间质百分比（stromal region）之外（图6D）。

图6. 使用预后模型对II期肿瘤风险组进行分类

讨论

该研究具有几个优点。首先，该研究分析了来自美国、加拿大和澳大利亚中心的大型CRC队列。其次，作者使用的方法允许与临床病理特征、分子突变和预后进行多重比较。第三，病理学家确定的TB分级和CD8免疫组化可用于一部分肿瘤，从而可以与QuantCRC特征直接进行比较。第四，作者将QuantCRC与阶段和MMR相结合，开发了一个强大的预后工具，不受观察者间的变异影响，并在外部验证队列中经过调整后显著预测了RFS，控制了已建立的风险因素。这项研究也存在一些局限性。QuantCRC依赖于Aiforia平台，可能会限制该模型的广泛应用。此外，QuantCRC仅应用于肿瘤的一个代表性切片；然而，仅从1个切片中获取有价值的预后信息，说明了量化方法的效力。作者也没有在临床环境中进行QuantCRC的前瞻性测试。总之，作者的研究结果表明，对CRC图像进行定量病理分析可以提供丰富的信息，用于增强常规病理报告。

结语

本文结果显示了定量数字病理学在CRC中提供已知组织学特征详细评估的潜力，并展示了数字化H&E图像中的巨大信息量。当利用这些信息时，可以增强常规病理报告，并作为预后生物标志物。

END 

参考文献： [1]  Pai RK, et al. Quantitative Pathologic Analysis of Digitized Images of Colorectal Carcinoma Improves Prediction of Recurrence-Free Survival. Gastroenterology. 2022 Dec;163(6):1531-1546.e8. 

撰写丨 诗怀雅叉烧猫 编辑、排版丨SX