科研丨华西医院＆中国环科院: 宏转录组学分析显示普雷沃氏菌是SARS-CoV-2感染患者口咽微生物组的潜在生物标志物(国人佳作)

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

COVID-19合并其他病毒感染的疾病严重程度和预后可能受到口咽微生物群的影响。然而，这些疾病如何受到患者口咽微生物组的不同影响？这方面的研究有限。本研究旨在探讨COVID-19患者口咽微生物群的特征，并将其与症状相似的患者进行比较。采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测SARS-CoV-2，对患者进行COVID-19诊断。通过对144例COVID-19患者、100例其他病毒感染患者和40名健康志愿者的口咽拭子标本进行宏转录组测序分析，对口咽微生物群进行了表征。结果显示，SARS-CoV-2感染患者口咽菌群多样性与其他病毒感染患者不同。普雷沃氏菌(Prevotella)和曲霉菌(Aspergillus)可能在区分SARS-CoV-2感染患者和其他病毒感染患者中发挥作用。普雷沃氏菌可能通过一种涉及鞘脂代谢调节途径的机制影响COVID-19患者的预后。本研究表明，SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者的口咽微生物组特征存在差异。普雷沃氏菌可作为诊断COVID-19和评价SARS-CoV-2感染时宿主免疫反应的生物标志物。此外，普雷沃氏菌、SARS-CoV-2和鞘脂代谢途径之间的相互作用可为COVID-19的精确诊断、预防、控制和治疗提供依据。

论文ID

原名：Metatranscriptomic analysis revealed Prevotella as a potential biomarker of oropharyngeal microbiomes in SARS-CoV-2 infection

译名：宏转录组学分析显示普雷沃氏菌是SARS-CoV-2感染患者口咽微生物组的潜在生物标志物

期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

IF：5.7

发表时间：2023.6

通讯作者：李为民，陈勃江，康玉麟

通讯作者单位：四川大学华西医院；中国环境科学研究院环境信息研究所

DOI号：10.3389/fcimb.2023.1161763

实验设计

结果

1. 纳入受试者的临床特征

284名受试者的人口统计学和临床特征见表1。在COVID-19患者组(Pos组)中，22.9%(33/144)的参与者年龄大于60岁，58.3%(84/144)的参与者为男性。Pos组144名受试者中，分别有7.6%(11/144)、70.8%(102/144)、9.0%(13/144)和12.5%(18/144)为轻度、中度、严重和重度症状。45.1%(65/144)的患者使用过抗生素。丙氨酸转氨酶(ALT)平均水平为22.5，高敏C反应蛋白(CRP)平均水平为8.75，淋巴细胞(LYMPH)平均水平为24.2，单核细胞(MONO)平均水平为6.2，中性粒细胞(NEUT)平均水平为66.1，降钙素原(PCT)平均水平为0.03。Pos组患者的治疗预后方面，56.9%(82/144)患者痊愈，16.7%(24/144)患者好转，20.1%(29/144)患者住院，0.69%(1/144)患者死亡，5.56%(8/144)患者无相关资料。值得注意的是，三组患者的年龄有显著差异(p < 0.001；表1)。

表1. 受试者的人口统计学特征和临床特征。

2. SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者口咽细菌的差异

总体而言，研究人员在284个研究样本中鉴定出780个细菌属。Pos组、感染其他病毒患者(Sus组)和健康对照组(Ctr组)样本中前10种细菌属的相对丰度分别如图1A-C所示。显然，Pos、Sus和Ctr组之间放线菌属(Actinomyces)、拟杆菌属(Bacteroides)、弯曲杆菌(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、Primorskyibacter和罗斯氏菌属(Rothia)的相对丰度发生明显变化(图1D)。此外，在上述7个细菌属中，LEfSe分析结果显示Pos组普雷沃氏菌富集，Sus组梭杆菌富集，Ctr组放线菌富集(图1E)。Pos、Sus和Ctr组间只有普雷沃氏菌的丰度有显著差异(p < 0.05；附表1；图1F)。然后，作者评估了普雷沃氏菌的丰度是否可以准确区分Pos组和Sus组以及Pos组和Ctr组。结果显示，Pos组和Sus组的普雷沃氏菌的曲线下面积(AUC)为0.669，Pos组和Ctr组的AUC为0.762(图1G)。此外，作者还评估了普雷沃氏菌是否可以评估宿主的免疫反应。Pos组普雷沃氏菌丰度与CRP值呈显著正相关(R = 0.55，p < 0.01，图1 h)。

图1. Pos组、Sus组和Ctr组受试者口咽细菌特征。(A) Pos组、(B) Sus组和(C) Ctr组相对丰度前10的细菌属的平均组成。(D)前20个细菌属在三组中的变化。(E) Pos组、Sus组和Ctr组之间细菌数量的差异。(F)三组间普雷沃氏菌(Prevotella)的相对丰度。(G)普雷沃氏菌在Pos组与Sus组、Pos组与Ctr组之间的ROC曲线。(H)普雷沃氏菌丰度与CRP值的相关性。LDA评分用三组间的差异程度表示。p值经Wilcoxon秩和检验证实。LDA，线性判别分析；ROC，受试者工作特征；AUC，曲线下面积。p<0.05(*)、p <0.01(**)、p <0.001(***)认为有统计学意义。

3. SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者口咽真菌的差异

总体而言，研究人员在284个研究样本中鉴定出了177个真菌属。Pos组、Sus组和Ctr组样品中前10个真菌属的相对丰度如图2A-C所示。其中，Pos、Sus和Ctr组之间曲霉属(Aspergillus)、马拉色菌属(Malassezia)和Daldinia的相对丰度变化明显(图2D)。此外，在上述三种真菌中，LEfSe分析结果显示，Pos组曲霉属相对丰度更高，Sus组马拉色菌相对丰度更高，Ctr组Daldinia相对丰度更高(图2E)。Pos、Sus和Ctr组之间只有曲霉属的相对丰度有显著差异(p < 0.05；附表2；图2f)。然后，研究人员评估了曲霉菌能否准确区分Pos组和Su组以及Pos组和Ctr组。结果显示，曲霉属在Pos组和Sus组之间的AUC为0.537，在Pos组和Ctr组之间的AUC为0.687(图2G)。此外，研究人员还评估了曲霉属是否可以评估宿主的免疫反应，但Pos组的曲霉属丰度与宿主免疫应答相关的临床指标均无显著相关性。

图2. Pos组、Sus组和Ctr组受试者口咽真菌特征。(A) Pos组、(B) Sus组和(C) Ctr组相对丰度前10的真菌属的平均组成。(D)前20个真菌属在三组间的变化。(E) Pos组、Sus组和Ctr组之间真菌数量的差异。(F)三组间曲霉属的相对丰度。(G)曲霉属在Pos组与Sus组之间、Pos组与Ctr组之间的ROC曲线。LDA评分用三组间的差异程度表示。p值经Wilcoxon秩和检验证实。LDA，线性判别分析；ROC，受试者工作特征；AUC，曲线下面积。p<0.05(*)、p <0.01(**)、p <0.001(***)认为有统计学意义。

4. SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者口咽病毒的差异

Pos样本中SARS-CoV-2的相对丰度显著高于Sus和Ctr样本(图3；补充表S3；p<0.05)。然而，猪C型肿瘤病毒、人α疱疹病毒1、人β疱疹病毒5、人γ疱疹病毒4、人乳腺腺病毒C、人偏肺病毒、鼻病毒A和鼻病毒C的相对丰度在Pos、Sus和Ctr组之间没有显著差异(图3；补充表S3；p>0.05)。

图3. Pos、Sus和Ctr组受试者口咽病毒特征。Pos、Sus和Ctr之间11种口咽病毒(包括SARS-CoV-2)的相对丰度变化。

5. SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者的口咽菌群多样性差异

为了探讨微生物丰富度和群落结构的差异，研究人员比较了SARS-CoV-2感染患者和其他病毒感染患者的口咽部微生物群落的α和β多样性。结果表明，Pos组、Sus组和Ctr组(Observed、Shannon、Chao1和Simpson指数)的α多样性差异很小(图4A、B；p > 0.05；附图1A、B；P > 0.05)。此外，β多样性结果显示，Pos组与Ctr组和Sus组具有差异性(图4C)。相似性分析(ANOSIM)图显示，组间差异大于组内差异(图4D， R= 0.183，p = 0.001)。

图4. Pos、Sus和Ctr组口咽微生物多样性特征。Pos、Sus和Ctr组之间的α多样性，包括(A) Observed index (NS: p>0.05)和(B) Shannon指数(NS: p>0.05)。(C)基于Bray-Curtis(加权)距离的主坐标分析(PCoA)结果显示，Pos组、Sus组和Ctr组之间的β多样性具有显著差异。颜色代表三个不同的组。PCoA1和PCoA2代表捕获大部分多样性的前2个主坐标。坐标所捕获的多样性的分数以百分数表示。(D)基于Bray-Curtis(加权)距离的相似性分析(ANOSIM)(R > 0，p < 0.05)。

6. 普雷沃氏菌在SARS-CoV-2感染中发挥了潜在作用

在本研究中，SARS-CoV-2感染患者的口咽微生物组的丰度和多样性与感染其他病毒的患者不同。因此，研究人员进一步分析了口咽微生物组在SARS-CoV-2感染中的潜在功能，以揭示其在感染中的潜在机制。结果显示，Pos组的革兰氏阴性菌的相对丰度(图5A；p < 0.001)略高于Sus组和Ctr组，而造成这种差异的主要细菌是普雷沃氏菌和拟杆菌(图5B)。Pos组革兰氏阳性菌的相对丰度显著低于Sus和Ctr组(图5C；P < 0.001)。造成这种差异的主要细菌是罗斯氏菌和放线菌(图5D)。上述结果表明，SARS-CoV-2感染病例口咽细菌以革兰氏阴性菌为主，以普雷沃氏菌为主。然后，研究人员尝试分析普雷沃氏菌的潜在作用，发现普雷沃氏菌的相对丰度与一些临床指标呈显著正相关(附图2A)，包括丙氨酸转氨酶(ALT；R = 0.50，p < 0.01)和结局(Outcome，R = 0.44，p < 0.05)。值得注意的是，Outcome值越高，预后越差(1，恢复；2，改善或持续；3，死亡)。此外，普雷沃氏菌的相对丰度与参与下列通路的普雷沃氏菌基因数量呈显著正相关(附图2B)：花生四烯酸代谢(ACM; R = 0.55，p < 0.01)、半乳糖代谢(GM; R = 0.54，p < 0.01)、异喹啉生物碱生物合成(IAB; R = 0.50，p < 0.01)、其他聚糖降解(OGD; R = 0.53，p < 0.01)、鞘脂代谢(SM; R = 0.61，p < 0.001)、类固醇激素生物合成(SHB; R = 0.51，p < 0.01)。有趣的是，普雷沃氏菌的相对丰度与SARS-CoV-2的相对丰度呈正相关趋势(附图3A；R = 0.028， p > 0.05)。ALT (R = 0.41，p < 0.05)和CRP (R = 0.62，p < 0.001)与Outcome值呈显著正相关(附图3B)。淋巴细胞(R =−0.57，p < 0.01)和单核细胞(MONO；R = - 0.41，p < 0.05)的百分比与Severity值呈显著负相关。然而，中性粒细胞(R = 0.50，p < 0.01)和降钙素原值(R = 0.54，p < 0.01)与Severity值呈显著正相关(附图3C)。值得注意的是，Severity值越高越严重(1，轻度；2，中等；3，严重；4，危重)。此外，已有研究报道鞘脂与SARS-CoV-2感染密切相关。基于这些结果，研究人员推断了普雷沃氏菌在SARS-CoV-2感染中的潜在机制(图6)。

图5. Pos组、Sus组和Ctr组中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。(A) Pos组中革兰氏阴性菌的相对丰度略高于Sus组(p < 0.001)。(B)造成这种差异的主要细菌是普雷沃氏菌和拟杆菌。(C) Pos组中革兰氏阳性菌的相对丰度低于Sus组(p < 0.001)。(D)造成这种差异的主要细菌是罗斯氏菌和放线菌。p值经Wilcoxon秩和检验证实。p<0.05(*)、p <0.01(**)、p <0.001(***)认为有统计学意义。  

图6. 普雷沃氏菌参与SARS-CoV-2感染的潜在机制。实线箭头表示来自本研究的结果，虚线箭头表示来自以往研究的结果。

讨论

本项研究首次利用宏转录组测序和分析揭示了SARS-CoV-2感染患者和其他病毒感染患者口咽细菌、真菌和病毒的不同组成。该研究还揭示了口咽微生物组在SARS-CoV-2感染中的潜在作用。 首先，Pos组、Sus组和Ctr组的α多样性(包括Observed、Shannon指数、Chao1指数和Simpson指数)差异很小。这一结果与之前的研究结果一致，即COVID-19患者和健康对照组之间的α多样性没有显著差异。β多样性分析结果显示，Pos组与Ctr组和Sus组略有差异。这说明SARS-CoV-2感染对口咽微生物群落分布的影响不同于其他病毒感染。这与先前一项研究的结果部分一致，该报告指出，SARS-CoV-2感染的模式与其他人类致病性呼吸道病毒(如甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒)的模式截然不同。 另一个需要提到的重要方面是，Pos组、Sus组和Ctr组之间曲霉属的相对丰度逐渐下降，Pos和Sus组之间的AUC为0.537，Pos和Ctr组之间的AUC为0.687。这表明曲霉属的丰度也可能在区分SARS-CoV-2感染和其他病毒感染方面发挥作用。此前的一项研究也表明，与SARS-CoV-2并发的继发性细菌和真菌感染可能主要由曲霉菌引起。这一发现进一步证实了我们的结果。 本研究最令人兴奋的发现之一是，在COVID-19患者(Pos组)、感染其他病毒的患者(Sus组)和健康受试者(Ctr组)之间，普雷沃氏菌的相对丰度存在显著差异。Pos组和Sus组的AUC为0.669，Pos组和Ctr组的AUC为0.762，表明普雷沃氏菌可以作为区分SARS-CoV-2感染患者和其他病毒感染患者的生物标志物。以往的研究结果显示，普雷沃氏菌是COVID-19患者上呼吸道的主要细菌，并且普雷沃氏菌在病毒性呼吸道感染(甲型流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒)患者中的丰度降低可以支持我们的研究结果。此外，Pos组革兰氏阴性菌的相对丰度略高于Sus组和Ctr组。造成这种差异的主要细菌是普雷沃氏菌和拟杆菌。SARS-CoV-2感染患者口咽细菌以革兰氏阴性菌为主，尤以普雷沃氏菌为主。这一观察结果与先前的研究结果一致，即革兰氏阴性病原体是COVID-19危重患者细菌性肺炎的主要原因。更重要的是，Pos组普雷沃氏菌丰度与CRP值呈显著正相关(R = 0.55，p < 0.01)，这提示普雷沃氏菌可作为评价SARS-CoV-2感染时宿主免疫应答的生物标志物。此外，之前也有报道CRP与病原体免疫反应之间的相互作用，而且CRP与先天免疫系统有关。 图6展示了普雷沃氏菌参与SARS-CoV-2感染的潜在机制。其潜在机制支持普雷沃氏菌参与下呼吸道免疫稳态。普雷沃氏菌属是革兰氏阴性厌氧菌，可促进炎症性疾病。肺部炎症与肺部微生物群与普雷沃氏菌的积累有关，而SARS-CoV-2感染患者比其他病毒感染患者更严重。另一个涉及的机制是鞘脂代谢途径。该通路调节病毒复制，影响病毒繁殖所需的宿主细胞信号通路，并调节宿主对感染的先天和适应性免疫反应。此外，鞘氨醇还能抑制SARS-CoV-2与其ACE2受体的相互作用。口咽菌群失调的人容易受到SARS-CoV-2感染，从而增加炎症。另一方面，SARS-CoV-2感染改变了普雷沃氏菌的平衡，促进了炎症。结果表明，Pos组普雷沃氏菌富集。作者推断，SARS-CoV-2升高可能诱导普雷沃特菌增加，其基因可能参与鞘脂代谢途径，而鞘氨醇可能反过来抑制SARS-CoV-2的增加。因此，普雷沃氏菌可能参与鞘脂代谢途径，影响COVID-19预后。

本研究也存在一些局限性。首先，临床数据不完整，导致无法比较参与者特征的差异，也无法显示Sus组中普雷沃氏菌丰度与CRP值之间的相关性。其次，抗生素的影响可能是呼吸道菌群的一个混杂因素，本研究中没有分析抗生素的影响。第三，没有对猪C型肿瘤病毒进行任何相关的解释，因为它被报道为与猪感染相关的病原体，而且它对人类的影响缺乏相关的研究。普雷沃氏菌的相对丰度与SARS-CoV-2相对丰度呈正相关趋势，但结果无统计学意义，r值较低。因此，普雷沃氏菌与疾病结局之间的关系必须通过单变量方法进行分析。第五，研究人员解释了普雷沃氏菌在COVID-19中发挥作用的潜在机制，但缺乏生物学实验，缺乏整体功能因子。因此，还需要进行研究来探索口咽微生物群(特别是普雷沃氏菌)在COVID-19发病过程中的整体分子机制。 综上所述，本研究揭示了SARS-CoV-2感染患者与其他病毒感染患者口咽微生物组的差异。此外，该分析首次探讨了口咽微生物组在SARS-CoV-2感染中的潜在机制。本研究发现SARS-CoV-2感染患者和其他病毒感染患者的口咽微生物组具有明显的差异。普雷沃氏菌和曲霉菌可以在区分两种感染类型方面发挥作用。普雷沃氏菌可能通过调节鞘脂代谢影响COVID-19的预后。

总之，本研究提供的证据表明，SARS-CoV-2感染患者的口咽微生物特征与其他病毒感染患者的口咽微生物特征不同。普雷沃氏菌可作为COVID-19和SARS-CoV-2感染中宿主免疫反应评价的生物标志物。普雷沃氏菌、SARS-CoV-2和鞘脂代谢途径的相互作用可为COVID-19的精确诊断、预防、控制和治疗提供依据。