纳米抗体免疫原性概况

前言

纳米抗体(Nbs)的特性（大小、单体状态、溶解性、缺乏Fc区域和短循环半衰期）有利于降低其与传统抗体相比的免疫原性，但它们对人体来说是外来物质，仍有可能引发免疫反应，因此分析其潜在的免疫原性变得非常重要。然而，尽管大多数生物制药的免疫原性已经进行了深入研究，但关于Nbs的免疫原性的信息仍然很少。本期小编为大家带来Chloé Ackaert 等研究者对于两款进入临床II的未经人源化改造的纳米抗体免疫原性的评估内容。值得一提的是这项研究的创新之处为研究纳米抗体的临床前免疫原性风险潜力提供了可借鉴的评估实验方法。

影响药物免疫原性的因素

(1) 结构特征如治疗性蛋白物与内源性等价物的相似性低，或在制备、储存和使用过程中，发生了不可逆的聚集现象。

(2) 生产相关因素例如生产过程产生的杂质和使用的溶液或添加剂。

(3) 患者相关因素特别是患者的基因型例如HLA类型，也会影响对药物的免疫反应状态和强度。

(4) 治疗相关因素例如剂量、频率、给药途径、在血液中的停留时间和联合用药。

Nbs 的免疫原性风险概况

研究者选择了两个在进行临床II期用于PET成像的Nbs进行评估。第一个Nb针对人表皮生长因子受体2（HER2），用于乳腺癌的PET成像。第二个Nb是针对巨噬细胞甘露糖受体（MMR），用于肿瘤相关的PET成像。

通过以下方式评估免疫原性风险状况：

(1) 分析I期患者的血清样本中是否存在ADA

(2) 检测Nbs的聚集倾向

(3) 检测Nbs在体外激活免疫原性的能力。

血清样本中抗药性抗体ADA的分析

首先对50名健康捐赠者的血清进行了存在ADA的分析（图1A,B），以确定ADA临界值（CP = 63.55 ECL计数）和特异性临界点（SCP = 19.7%）。在68Ga-NOTA-anti-HER2-Nb I期研究（EudraCT 012-001135-31）中，对所有20名患者的血清中是否存在ADA进行了分析。20名患者的血清是在注射68Ga-NOTA-anti-HER2-Nb之前和之后3个月获得的血清。

在筛选试验中，有4名患者的ECL计数高于筛选阈值。在确认试验中，只有13号病人有ADA的存在。确认试验中的信号比筛查时减少，意味着该患者在注射68Ga-NOTA-anti-HER2-Nb之前，ADA就已经存在。该患者在注射68Ga-NOTA-anti-HER2-Nb后3个月的血清中只发现ADA略有增加，而且没有观察到毒性症状或迹象。68Ga-NOTA-anti-HER2-Nb在该患者身上的生物分布与所有其他没有ADA患者的生物分布比较未能发现任何差异。

图1. ECL测量健康志愿者和患者样本中的ADA。

用电化学发光法（ECL）对50个健康捐赠者的血清样本进行抗药性抗体（ADA）分析，以确定临界点（A,B），并对参加I期PET研究的20个患者样本进行分析，包括在注射Nb示踪剂之前和之后的3个月（C）。在20名患者中，有4名患者的ECL结果呈阳性（即信号高于筛选截止点，用绿色水平线表示），其中一名患者（#13）在注射Nb前和注射3个月后的血清中都有ADA。

Nbs抗聚积能力强

蛋白质的聚集会增加药物的免疫原性。对NOTA偶联的Nbs的动态光散射（DLS）分析表明它们主要是单体状态，没有观察到明显的聚集物质的迹象，证实了Nbs与传统的抗体相比，Nbs对聚集的抵抗力更强。两种Nb的流体力学半径（hydrodynamic radius，Rh）被确定为1.615纳米和1.835纳米。

图2. 两种纳米抗体动态光散射（DLS）测量。黑点和直线分别代表实验数据和拟合结果。

Nbs不引起moDCs和cDCs的激活

为了进一步检测Nbs可能存在的免疫原性风险、研究者通过分析moDCs和cDCs的表面标志物（CD40、CD80、CD83、和CD80和HLA-DR）测量anti-HER2-Nb和anti-MMR-Nb（NOTA偶联和非偶联两种形式）对DCs的激活能力。实验中使用的Nb样品，以及赫赛汀(Trastuzumab, 一种人源化的anti-HER2 mAb）和英夫利西单抗（Inflfliximab，一种嵌合的抗TNF-α的mAb)都不含内毒素，而小鼠IgG，可以检测到残留的内毒素。

在分析的九个捐赠者中，与KLH、LPS、和小鼠IgG相比，检测表明Nbs并没有引起moDCs表面生物标志物的上调（图3A）。对于cDCs，观察到cDC1和cDC2细胞类型有不同的反应。与cDC2细胞相比，cDC1细胞的表面标志物的上调略高（图3B,C）。没有一个捐赠者显示出一个以上的共刺激分子的表达。

图3. 在不同的抗原刺激下检测人moDCs和cDCs的表面标志物表达。

将体外诱导的moDCs（A）和直接分离的原生cDCs（B,C）暴露于对照抗原(其中阳性对照为LPS和KLH）或Nbs 24小时，或不作诱导(UI)。用流式细胞仪分析五种不同的表面标志物（CD80、CD83、CD86、CD40和HLA-DR）。结果以中位数表示。荧光强度（MFI）表示为25个（moDCs）或9个（cDCs）独立实验的中位数（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, Mann-Whitney检验）。

Nbs不引起DCs细胞因子的释放

接下来，研究者分析了DC在接触纳米抗体后分泌的细胞因子以进一步评估其潜在的免疫原性风险。阳性对照组中的moDCs和cDCs诱导明显，都检测到IL-12、IL-6、IL-10和TNF-α。而Nbs组都没有引起DCs产生可测量的细胞因子释放（图4）。

图4. 人moDCs和cDCs在受到不同抗原刺激后分泌的细胞因子。

体外诱导的moDCs（A）和直接分离的健康捐赠者的cDCs（B）暴露于对照抗原或Nbs 24小时，或不诱导(UI)。通过ELISA分析培养上清中IL-12、IL-6、TNF-α和IL-10的分泌。共分析了来自22个供体的moDCs，和来自9个供体的cDCs。(* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001, Mann-Whitney test).

Nbs不引起moDCs共培养后的T细胞增殖

将负载对照抗原或Nbs的moDCs（分为成熟组和未成熟组）与自体T细胞以1/10的比例共培养6天。在共培养的最后15小时内，通过检测3H-thymidine的结合来评估T细胞增殖。

实验结果显示，T细胞与暴露于Nbs的成熟moDCs共同培养时，没有额外的3H-thymidine的结合，表明Nbs对自体的T细胞无刺激。与此相反，作为阳性对照，暴露于小鼠IgG的moDCs可诱导T细胞增殖，当moDCs处于未成熟状态时也能观察到这种强效的增殖。并且值得注意的是NOTA偶联的Nbs也不引起细胞增殖，这与已发表的结果一致表明螯合剂的免疫原性取决于它所连接的蛋白的免疫原性。

图5. 与不同抗原刺激的自体moDCs共同培养后的T细胞增殖。

将体外诱导的成熟moDCs(A) 或未成熟moDCs(B)暴露于对照抗原或Nbs与自体T细胞共培养6天，通过3H-thymidine结合监测细胞增殖。结果以每分钟计。（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001）。

小结

尽管人类和骆驼类的免疫球蛋白重链可变区基因（IGHV3和IGHV4）之间有高度的同源性，分别为86-94%和79-89%。与传统抗体相比，Nbs的免疫原性被认为很低，但仍然是医药研究者们密切关注的话题。本期分享的内容，研究者首次采用ADA测定、聚集分析和体外免疫原性评估相结合的方法来报告Nb的免疫原性情况，基于数据，研究者得出结论这些非人源化的Nbs是具有低免疫原性风险的治疗候选物。

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