基因检测如何指导晚期甲状旁腺癌治疗？

甲状旁腺癌（PC）是一种极其罕见的恶性肿瘤，术后复发风险高。针对PC的全身治疗尚未确定。本研究纳入了4例晚期PC患者，这些患者进行了全基因组和RNA测序，寻找可以指导临床管理的分子变异。2例患者通过基因组和转录组测序发现靶点，进行试验性治疗，获得生化缓解和长期疾病稳定：（a）基于高肿瘤突变负荷和APOBEC过度激活相关单碱基置换特征，进行免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗治疗；（b）基于FGFR1和RET过表达，进行多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼治疗，以及（c）在病程后期，基于同源重组修复缺陷（HRD），进行PARP抑制剂奥拉帕利治疗。此外，本研究数据使我们对PC分子图谱有了更多了解，涉及全基因组特定突变过程足迹和致病性胚系变异。这些数据强调了全面分子检测的潜力，有助于对疾病生物学的了解，改善罕见癌症患者的治疗。

研究背景

甲状旁腺癌（PC）是一种极为罕见的恶性肿瘤，发病率约为0.03/10万人/年。在绝大多数情况下，肿瘤性甲状旁腺激素分泌会导致高钙血症，这可能危及生命。PC占所有原发性甲状旁腺功能亢进症病例的<1%。然而，诊断很少在术前检查期间做出，而是基于组织病理学，包膜和血管浸润是恶性肿瘤的主要特征。手术是PC的唯一治愈方法。

在一项纳入了83例PC患者的回顾性研究中，疾病特异性总生存期较优，但近40%的患者复发。与较长的无复发生存期相关的因素包括肿瘤分期低、Ki67指数<10%、术后钙水平恢复正常以及无淋巴结（LN）侵犯。大多数病例的复发是局部的，手术是主要的治疗方法，但可能导致严重的并发症，如喉返神经麻痹。<10%的患者发生远处转移。迄今为止，对于局部晚期或转移性PC患者，除了拟钙剂西那卡塞控制高钙血症外，尚无全身性治疗方案。

PC的已知分子驱动因素包括CDC73和MEN1胚系和体细胞突变。此外，在多达三分之一的患者中观察到PI3K-AKT-mTOR（PAM）通路激活和CCND1扩增。尽管全基因组研究使人们对PC的分子特征有了更好的了解，但尚未报道可靶向治疗的基因组或转录组变异。

国家肿瘤疾病中心（NCT）、德国癌症研究中心（DKFZ）和德国癌症联盟（DKTK）开展了前瞻性观察性研究MASTER，应用全基因组/外显子组测序（WGS/WES）和RNA测序（RNA-seq）为晚期恶性肿瘤年轻成人患者和无法治愈的罕见癌症患者的治疗提供信息。本研究描述了参加MASTER的4例晚期PC患者的分子谱，首次证明了广泛的分子检测对该疾病的临床管理的效用，包括靶向治疗策略的应用。

研究结果

基因图谱

主要临床特征见表1。所有患者均接受过多次手术治疗，并使用西那卡塞控制钙。WGS识别了中位92个功能性体细胞SNV（PC-A，496；PC‐B，45；PC-C，14；PC-D，139）和中位9个功能性体细胞插入缺失（PC-A，7；PC‐B，18；PC‐C，1；PC-D，11）。在所有患者中，14/731个功能性体细胞突变发生于已知和候选PC驱动基因。

表1. 临床特征

6个基因（CDC73，MEN1，MSH6，CCND1，DICER1和HRAS）变异有不止一例患者检出（图1A）。PC-A携带2个CDC73失活突变（p.Y97*和p.W32Dfs*21）。PC-B携带CDC73 K34Rfs*3移码缺失和LOH，导致CDC73双等位基因失活。PC-C携带染色体11q13.1 LOH，包括MEN1。PC-D携带MEN1 p.Q547_S561delinsH框内缺失。PC-A携带2个MSH6体细胞错义突变（p.D135N和p.S574L），被归为意义未明的变异。免疫组化未显示错配修复蛋白表达缺失，提示良性突变。PC-B和PC-C携带CCND1扩增，PC-C和PC-A存在CCND1异常过表达，但未观察到PC-A存在CCDN1体细胞或胚系变异。HRAS和DICR CNV或SV各有2个样本检出。

图1. PC基因图谱

MTOR磷脂酰肌醇3和4激酶结构域错义突变p.E2181K（尚无功能描述），TP53 DNA结合结构域终止突变p.S183X，RB1错义突变p.H483Y（尚无功能描述），ATRX终止突变p.S567X，各有1例患者检出。PC-A和PC-D的肿瘤突变负荷（TMB）较高，有503和150个功能性体细胞SNV和插入缺失。

在3例患者中观察到在HRD相关癌症中非常普遍的单碱基置换特征3（SBS3）（图1B）。所有患者均观察到SBS2和SBS13，其与生理诱变酶APOBEC（载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样）过度活化有关，PC-A和PC-D更显著，一例达到90%。1例患者存在SBS18，下文将更详细地讨论。

4例患者共检出821个CNV（图1C），拷贝数缺失（中位91；范围20-121）多于拷贝数增加（中位62.5；范围5-200），在所有4个样本中均观察到拷贝中性LOH（中位26.5；范围20-95），PC-D存在全基因组LOH。1、3、6、9 和 13号染色体拷贝数缺失频率较高，1、5、7 和 20 号染色体拷贝数增加频率较高。染色体3q缺失较常见，在3个样本中检测到。在3个样本中观察到基因组不稳定性特征，2例患者全基因组倍增，1例患者存在HRD（由LOH-HRD评分和LST定义）。MSIsensor显示所有患者均微卫星稳定，结果低于阈值3.5。

这4例患者携带8个已知癌症易感基因共13个罕见胚系变异。PC-D携带MUTHY p.G393D杂合变异，归类为致病性。MUTYH编码DNA糖基化酶mutY，其去除与8氧代脱氧鸟苷或鸟嘌呤错配的腺嘌呤残基。PC-D还携带MUTYH体细胞LOH，导致MUTYH双等位基因失活，造成结直肠癌和MUTYH相关息肉病的遗传易感性。有趣的是，该样本还显示SBS18，很可能是由MUTYH变异和体细胞LOH引起的。免疫组化显示，在存档肿瘤组织但非对照样本中，8-氧鸟嘌呤染色增加，核仁显著（图2）。

图2. 存档组织标本8-oxoG免疫荧光显微镜检测

激酶表达谱

为了鉴定潜在可用药信号通路的异常激活，分析了138种激酶的表达模式，这些激酶至少可以使用一种FDA批准的小分子抑制剂进行靶向治疗。分析发现，与PC-C和PC-D相比，PC-A和PC-B中RET和FGFR1过表达引人注目（图3A，C）。

图3. PC激酶表达谱

考虑4个样本中表达前25%的激酶基因，7种激酶抑制剂被确定为潜在疗法，这些抑制剂至少覆盖5个靶点，这些靶点至少有一个样本存在（图3B，C）。达沙替尼、帕纳替尼和博舒替尼是基于生物标志物的疗法，用于慢性髓系白血病和费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病。达拉非尼是一种突变型BRAF特异性抑制剂，被批准用于黑色素瘤和非小细胞肺癌。尼达尼布对VEGFR、FGFR和PDGFR具有活性，被批准与多西他赛联合用于非小细胞肺癌。伊布替尼是一种BTK抑制剂，获批用于治疗淋巴瘤。仑伐替尼主要靶向VEGFR和FGFR家族成员，在较小程度上靶向RET和KIT，单药获批用于治疗肝细胞癌和分化型甲状腺癌。

为了探索无法通过单个激酶基因表达评估的通路活性变化，进一步使用了PROGENy算法。PC-A观察到PIK3CA，MAPK和WNT信号通路富集，而PC-D表现为NFkB、TNFa、JAK-STAT、VEGF和Trail通路上调。

基因组学和转录组学指导的治疗

在MASTER研究中，生物标志物和治疗推荐基于所涉及的细胞通路或过程分为八个分子干预组：酪氨酸激酶（TK），PI3K-AKT-mTOR（PAM），RAF-MEK-ERK（RME），细胞周期（CC），发育调节（DEV），DNA损伤修复（DDR），免疫逃逸（IE）和其他（OTH）。

向每位患者至少推荐了2种靶向疗法，包括IE（3例患者），TK（3例患者），PAM（2例患者），DDR（2例患者），DEV（1例患者）和CC（1例患者）。向2例患者推荐了联合治疗。2例患者进行了分子检测指导的治疗。

PC-A是一名43岁女性，患有局部晚期PC，初始治疗后12年处于缓解状态，随后发生腹部LN转移。基于转移灶样本高TMB（496个功能性体细胞SNV和7个功能性体细胞插入缺失）和APOBEC突变特征SBS2和SBS13，推荐使用PD-1抑制剂帕博利珠单抗。有趣的是，与其他3例患者相比，免疫浸润分析工具immunedeconv CIBERSORT反卷积算法显示活化的CD8阳性T细胞、滤泡辅助性T细胞、炎性M1巨噬细胞较多，调节性T细胞（Tregs）较少，提示免疫检查点抑制剂治疗应答表型。在同情用药的基础上开始帕博利珠单抗治疗，疾病稳定12个月，生化缓解明显。

PC-B是一名51岁男性，患有局限性PC。初次切除术后4年复发，出现肺和颅底转移，为此，再次进行手术干预。快速进展需要颅底放疗。颅底转移灶分子分析显示FGFR1和RET过表达，使用仑伐替尼治疗。获得生化完全缓解，治疗持续了3个月。由于不良事件，停止治疗，5个月后发生影像学和生化进展。由于存在BRCA2体细胞缺失和SBS3，开始PARP抑制剂奥拉帕利治疗，疾病稳定持续14个月（图4），随后恢复仑伐替尼治疗。

图4. 患者PC-B对仑伐替尼和奥拉帕利的生化反应

PC-C是一名39岁男性，接受了左甲状旁腺切除术和腺叶切除术，获得13年缓解。随后，出现局部复发，发生LN转移，为此接受了多次手术，随后参加MASTER研究。该患者已失访，没有关于治疗或疗效的信息。

最后，患者PC-D是一名82岁女性，患有局限性PC。初次手术后1年，发生肺转移。免疫组化显示生长抑素受体5高表达，使用Lu-177 DOTATOC进行两个疗程的肽受体介导的放射性核素治疗，但这并没有阻止LN转移的进展。对1个LN手术活检样本进行分子检测，但还未能考虑靶向治疗，患者便死于疾病进展。对于该患者，基于高TMB，推荐了免疫检查点抑制治疗，尽管免疫细胞反卷积显示肿瘤前肿瘤微环境的特征是Treg和免疫抑制M2巨噬细胞较多，M1巨噬细胞、CD8阳性T细胞和滤泡辅助性T细胞较少。

讨 论 

本研究是首次对晚期PC进行了全基因组和转录组分析，来指导该超罕见癌症患者标准治疗失败后的临床管理。使用NCT/DKFZ/DKTK MASTER研究确立的标准化流程对晚期癌症年轻成人和难治性罕见恶性肿瘤患者进行分析。所有4例患者均获得分子检测指导的治疗推荐，并且在实施治疗的2例患者中，观察到生化缓解和长期疾病稳定。

DNA和RNA测序都提供了有价值的临床信息。由于全基因组和RNA测序需要冷冻保存的肿瘤组织（如本研究），因此无法与存档的原发性和转移性病灶组织样本进行直接比较，来阐明PC的空间和时间异质性。然而，先前有研究探索了福尔马林固定石蜡包埋样本靶向RNA表达，发现不同患者原发性肿瘤和转移灶的基因表达存在显著差异。

与先前研究数据一致，本研究中，2/4例患者检测到体细胞CDC73突变，与更具侵袭性的病程和TMB较高有关。此外，还证实了CCND1扩增伴过表达在PC中较常见，提示一部分PC取决于该可用药通路失调，一例患者因此被推荐CDK4/6抑制剂。TP53有害突变在PC中很少见，与更具侵袭性的临床病程有关。与此一致，本研究队列中的TP53突变PC患者在1年后复发，临床表现快速恶化。其他抑癌基因在PC中的致病作用和潜在临床意义在很大程度上尚不清楚。我们在3/4个样本中观察到染色体3q缺失，提示一个或多个这类基因可能位于该区域。

2例患者TMB较高，可归因于两种不同的分子机制。PC-D携带MUTYH胚系杂合性突变，该患者肿瘤组织检出MUTYH LOH，与特征性SBS18相关，免疫组化显示氧化DNA损伤增加支持这一点。胚系MUTYH双等位基因突变与腺瘤性息肉病和结直肠癌风险增加有关，而杂合性突变携带者的相对癌症风险尚不明确。由于LOH导致另一个MUTYH等位基因功能缺失，MUTYH单等位基因变异促进肿瘤发生。MUTYH缺陷肿瘤中特有的C到A碱基置换增加了终止密码子的形成，导致抑癌基因失活。本研究所见的拷贝中性LOH和全基因组倍增类似于肾上腺皮质癌中观察到的模式，据报道，肾上腺皮质癌是MUTYH杂合性变异携带者最常患的癌症，MUTYH在该例PC的发生中可能起作用。

此外，第二例TMB较高的患者PC-D表现出SBS2和SBS13，归因于APOBEC胞苷脱氨酶活性，占人类癌症特征的三分之一以上。由于SBS2和SBS13与免疫检查点抑制疗效有关，因此是这两例患者治疗推荐考虑的生物标志物之一。PC-A获益于PD-1抑制剂帕博利珠单抗治疗，获得生化缓解和长期疾病稳定，并且在再次手术后2年多，无肿瘤，生化指标无疾病迹象。

PC-A和PC-D的临床病程强调了在晚期PC的检查中包括多种生物标志物的临床实用性，这两例患者为TMB和突变特征。这种需要全面分子分析的一般策略也得到了PC-C的支持，对于该患者，HRD和HRD-LOH为PARP抑制剂的使用提供了依据，仑伐替尼治疗后使用了PARP抑制剂，带来长期疾病稳定。

最近的研究表明，转录组分析可以显著增加分子检测指导的临床试验的入组患者数量。在MASTER试验中，RNA-seq显著扩展分子检测指导的治疗选择，特别是TK组。本研究分析了RNA-seq结果，除了检测致癌融合基因和异常表达的单基因外，基于抑制剂对各种TK活性相关试验数据，得出预测疗效的表达特征。在四例患者中，通过将过表达激酶基因与FDA批准的抑制剂靶谱相匹配，发现达沙替尼和帕纳替尼为靶标最多的化合物，对5至16个过表达激酶基因具有抑制活性。此外，在PC-A和PC-B中，FGFR1和RET过表达促使MTB推荐仑伐替尼治疗。PC-B获得显著的生化缓解，甚至需要低钙血症作为反应指标，并且疾病稳定8个月。在这例获益较多的患者中，当仅考虑具有高结合亲和力的（阈值1μm）表达前25%的激酶时，只有RET是仑伐替尼的靶标，而FGFR1不是。结合RET在PC-A中的强烈过表达，这些观察结果提示RET信号通路在一部分PC的发展和/或进展中起作用，这一假设需要在临床前模型和临床中进一步验证。值得注意的是，之前一项比较甲状旁腺腺瘤、非转移性和转移性PC的研究发现，FGFR1是转移性与非转移性PC中过表达的基因之一，同时也强调FGFR1抑制剂是一种潜在的治疗策略。

总之，本研究结果揭示了PC分子发病机制的新方面，特别是APOBEC特征SBS2和SBS13反映的突变过程的重要性，MUTYH胚系杂合性突变作为潜在的易感因素，以及较常见的FGFR1和RET过表达。值得注意的是，其中一些特征提供了新的治疗靶点。因此，本研究强调了基于多组学的泛癌种精准肿瘤学项目的科学和临床价值，这在很少有标准治疗方案的非常罕见和了解较少的癌症（如PC）中尤为明显。

参考文献：

Teleanu MV, Fuss CT, Paramasivam N, Pirmann S, Mock A, Terkamp C, Kircher S, Landwehr LS, Lenschow C, Schlegel N, Stenzinger A, Jahn A, Fassnacht M, Glimm H, Hübschmann D, Fröhling S, Kroiss M. Targeted therapy of advanced parathyroid carcinoma guided by genomic and transcriptomic profiling. Mol Oncol. 2023 Jul;17(7):1343-1355. doi: 10.1002/1878-0261.13398. Epub 2023 Apr 11. PMID: 36808802; PMCID: PMC10323885.

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