快报｜二线抗结核药物治疗对利福平耐药肺结核患者肠道菌群的影响

作者：吴春丽，易恒仲，胡艳梅，罗丹霖，唐志冈，文新民，张勇，唐蜜，张丽芝，吴姝，陈梦施

第一作者及单位：吴春丽，中南大学/公共卫生学院

通信作者及单位：易恒仲，湖南省结核病防治所（湖南省胸科医院）/耐药科

Effects of second-line anti-tuberculosis drugs on the intestinal microbiota of patients with rifampicin-resistant tuberculosis

Front Cell Infect Microbiol，2023，13:1127916.

doi: 10.3389/fcimb.2023.1127916.  

PMID: 37187470.

研究背景

结核病（tuberculosis，TB）是一种威胁人类健康的慢性传染性疾病，利福平耐药结核病（RR-TB）是指结核病患者感染的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）体外药物敏感性试验（简称“药敏试验”）证实对利福平耐药的结核病。结核病患者一旦出现耐药情况，其治疗难度就会增加，治疗周期更长，治疗成本也更高。近年来，新型冠状病毒感染大流行严重影响着结核病的诊断和治疗以及结核病疾病负担，耐药结核病（drug-resistant tuberculosis，DR-TB）的负担也有所增加。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布的《2022年全球结核病报告》显示，2021年全球新增RR-TB患者45万例，而我国新增耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）患者3.3万例。

肠道微生物对维持人体健康具有重要作用。目前的研究发现，肠道微生物的组成和代谢活动可影响人体免疫系统的发育和功能，对机体的抗结核免疫反应具有一定的调节作用。抗结核药物会引起机体肠道微生物群的组成和功能紊乱，特别是RR-TB需要联合应用多种二线抗结核药物进行长期治疗，对机体肠道微生物的稳态影响更大。目前，针对抗结核药物治疗对患者肠道菌群的影响的相关研究更多地集中在对一线药物组成的标准治疗方案上，而对二线抗结核药物对肠道微生物群的影响关注还很少。本研究将使用宏基因组学技术分析在RR-TB患者中接受二线抗耐药结核药物治疗强化期、巩固期与曾接受常规一线抗结核药物治疗且未接受二线药物治疗患者的肠道菌群差异，研究接受二线抗耐药结核药物治疗强化期和巩固期患者的微生物组成和差异菌种，并结合功能分析探索肠道微生物相关功能的改变情况。

研究方法

采用横断面研究方法，收集2021年9月至2022年5月在湖南省胸科医院（湖南省结核病防治所）耐药专科收治的RR-TB患者的粪便样本和临床资料。纳入标准：年龄＞18周岁；能够理解研究过程并自愿参与研究；结核病患者感染的结核分枝杆菌传统表型药敏试验/基因检测证实对利福平等一种以上抗结核药物耐药。排除标准：肠结核患者；合并心脑肝肾等器官功能不全者；合并消化道疾病者；不能耐受二线抗结核药物治疗者。

采集的粪便样本进行相应的宏基因组测序，构建文库，并将得到的原始数据进行下一步的分析与注释。采用生物信息学方法进行基因预测及丰度分析、物种注释信息和功能注释，比较物种及功能构成差异。计算Shannon指数和Simpson指数进行Alpha多样性分析比较，再通过PCoA分析与Anosim分析进行Beta多样性比较。基于物种相对丰度表和功能相对丰度，使用LEfSe软件进行组间差异的比较。

研究结果

1.患者分组：本研究共纳入RR-TB患者150例。其中，初诊RR-TB未接受二线抗结核药物治疗的结核病患者30例（Control组）、接受二线抗结核药物治疗强化期6个月内的患者60例（G1G2组）、接受二线抗结核药物治疗巩固期12～14个月内的患者60例（G3G4组）。不同组别研究对象的基本人口学特征见表1。G1G2组与G3G4组患者二线抗结核药物用药情况见表2。

2.不同组别肠道内微生物群物种构成和多样性变化：多样性通过比较三组间的Shannon指数和Simpson指数，发现差异均无统计学意义，这表明在本研究中RR-TB患者经二线抗结核药物治疗后，未引起肠道内微生物群多样性的明显变化（图1）。β多样性分析发现，G1G2组的物种组成与control组相似度较小，而G3G4组与control组和G1G2组的物种组成更相似，差异有统计学意义（图2，表3）。表明与尚未接受过二线抗结核药物治疗的初诊RR-TB患者相比，RR-TB患者在接受二线抗结核药物治疗后改变了肠道微生物群物种构成，其中接受二线抗结核药物强化期治疗的患者引起肠道微生物物种组成的变化更大，但并未影响肠道微生物群的多样性。

图1  肠道微生物群的Alpha多样性：Shannon指数(A)、Simpson指数(B)

注 横坐标表示一个主成分，纵坐标表示另一个主成分，百分比表示主成分对样品差异的贡献值；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示  图2 基于种水平的物种 PCoA （A）和 NMDS（B）结果展示

3.不同组别肠道内微生物群物种构成和丰度变化：观察到接受二线抗结核药物治疗后，患者肠道微生物群构成与丰度发生了显著改变。门水平上，与control组相比，变形菌门、厚壁菌门在G1G2组和G3G4组的相对丰度均较高，表现为先增加再逐渐减少；拟杆菌门在G1G2组和G3G4组的相对丰度先减少再逐渐增加；子囊菌门、放线菌门在control组、G1G2组和G3G4组中的相对丰度均逐渐减少（图3A）。种水平上，与对照组相比，使用二线抗结核药物治疗使13个菌种的相对丰度发生了明显下降（图3B，表4），而在强化期治疗组中有14个差异富集的菌种（表5）。此外，Bifidobacterium adolescentis和Megamonas hypermegale在G1G2组时相对丰度下降，在G3G4组时相对丰度显著上升；Butyricicoccus pullicaecorum和Kluyvera georgiana的相对丰度在G3G4组中显著上升（表6）。

4.二线抗结核药物治疗对患者肠道菌群的功能影响：KEGG富集分析发现各组在代谢相关功能的相对丰度最高（图4）。LEfSe分析显示，苯丙氨酸和酪氨酸及色氨酸的生物合成、酚醛酸的生物合成、柠檬酸循环、氧化磷酸化等途径相关的肠道菌群功能均在control组明显增强；赖氨酸降解、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和细胞色素P450对异类生物的代谢作用等途径相关的肠道菌群功能均在G1G2组明显增强。而丙氨酸和天门冬氨酸及谷氨酸的代谢、氨基酸糖和核苷酸糖的代谢、硫胺素的代谢在G3G4组明显增强。此外，研究还发现在对照组中菌群富集在结核病，而强化期治疗组中功能富集于抗药性（图5）。均说明二线抗结核药物治疗对患者肠道菌群的功能产生了一定影响。

图4  功能注释在KEGG level1上的相对丰度柱形图

图5  LEfSe鉴定control组、G1G2组和G3G4组肠道菌群基因存在显著差异的功能分类(level 3)

研究结论

二线抗结核药物治疗RR-TB患者可引起患者体内肠道菌群结构组成发生改变，以及大肠埃希菌等11种条件致病菌菌种的相对丰度明显增加；功能分析显示，苯丙氨酸等物质生物合成功能明显降低，代谢功能明显升高。

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供稿：李瑶和易恒仲

编辑：孟    莉

审校：郭    萌

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