科研丨赣南医学院: 肠道菌群失调和粪便代谢物变化对心理应激小鼠的影响(国人佳作)

编译：微科盟溧阳

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

心理压力可引起情感性障碍。肠道菌群在情绪功能调节中起重要作用。然而，肠道微生物群与心理压力之间的关系尚不清楚。本文研究了心理应激对肠道微生物群和粪便代谢物的影响，并评估了情感障碍行为与粪便微生物改变之间的关系。建立C57BL/6J小鼠心理应激模型，蔗糖偏好实验、强迫游泳实验和旷场实验有助于评估焦虑和抑郁样行为。利用应激和非应激小鼠的粪便样本进行粪便菌群移植(FMT)。此外，还进行了16S rRNA测序和非靶向代谢组学研究。结果显示，应激暴露14天后，观察到焦虑和抑郁样行为明显增加。相比于非应激小鼠的“正常菌群”的FMT，心理应激小鼠的“情感障碍菌群”的FMT增加了应激敏感性。16S rRNA分析发现，应激小鼠肠道中Bacteroides、Alistipes和Lactobacillus丰度降低，Parasutterella和Rikenellaceae_RC9_gut_group丰度升高；此外，应激小鼠表现出差异代谢物谱。KEGG通路分析表明，差异代谢物主要参与α-亚麻酸代谢、味觉传导、半乳糖代谢等下调通路。多种代谢物与Alistipes和Bacteroides呈正相关，而与Parasutterella呈负相关。综上，本研究结果表明，肠道微生物群失调促进心理应激反应的情感障碍发展。

原名：Implications of gut microbiota dysbiosis and fecal metabolite changes in psychologically stressed mice

译名：肠道菌群失调和粪便代谢物变化对心理应激小鼠的影响

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：5.2

发表时间：2023.5

通讯作者：李延柠，陈昌荣

通讯作者单位：赣南医学院基础医学院；赣南医学院第一附属医院

DOI号：10.3389/fmicb.2023.1124454

实验设计

前言

情感性障碍在世界各地非常普遍。长期或反复暴露在生理和心理压力下是其发展的主要风险因素。应激条件下情感障碍的机制尚未完全阐明。据报道，肠道微生物群在调节情绪功能方面起着至关重要的作用。人类肠道是一个极其复杂的生态系统，拥有近100万亿个细菌。微生物群与肠上皮之间的相互作用可以间接引起大脑的生理变化，也会影响情绪和行为。此外，在情感障碍患者和精神疾病动物模型中存在肠道微生物群紊乱现象。据报道，重度抑郁症患者粪便微生物群落中Prevotella和Klebsiella比例的变化与汉密尔顿抑郁评定量表一致。肠道菌群失调也被发现会在正常小鼠中诱发抑郁样症状。 肠道微生物对应激源很敏感，下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的激活可以明显影响菌群水平。越来越多的研究报道，应激不仅使肠道通透性增加，而且促进细菌感染和侵袭，导致肠道菌群组成发生变化。应激可以改变肠道微生物组，最终导致应激诱导的免疫功能、神经发育和行为的改变。先前的研究发现，在对照组和创伤后应激障碍暴露小鼠中，受影响最大的属是Oscillospira、Lactobacillus、Akkermansia和Anaeroplasma。此外，多种物理应激模型诱导肠道菌群失调，脂质和氨基酸代谢的改变是粪便代谢组的特征。 心理和生理应激对动物认知、情感和生理功能的影响不同。为了引起纯粹的心理应激，避免生理应激的干扰，本研究采用Communication box建立C57BL/6J小鼠心理应激模型。本研究旨在研究心理应激对肠道微生物群和粪便代谢物的影响，并探讨心理应激下情感障碍与粪便微生物群改变之间的关系。

结果

1.心理应激导致体重下降和情感障碍行为

心理应激14天后，记录小鼠体重，并进行行为学测试(图1B)。结果发现应激小鼠的平均体重明显低于非应激小鼠(图1C)。通过蔗糖偏好实验(SPT)和强迫游泳实验(FST)评估抑郁样行为，发现与非应激小鼠相比，应激小鼠的蔗糖消耗量显著减少(图1D)，静止时间更长(图1E)。此外，通过旷场实验(OFT)评估焦虑样行为，与非应激小鼠相比，应激小鼠待在空地中心的时间明显减少(图1F)。总体而言，这些数据表明，心理压力会导致小鼠体重减轻和情感障碍行为。

图1. 心理应激对情感性障碍行为的影响。

(A)建模装置的构造；(B)心理应激时间线和行为程序；(C)小鼠周体重[F(1,28) = 4.815，P= 0.0367]；(D)通过SPT评估蔗糖偏好(t = 4.664, P < 0.001)；(E)通过FST测量静止时间(t = 3.782, P= 0.0014)。(F)在空地中心停留的时间(t = 3.585, P= 0.0021)；数值为平均值±SD, C：n = 15/组；D-F：n = 10/组。

2.心理应激引起的肠道菌群失调

为了研究心理应激是否会引起肠道菌群的明显变化，我们对粪便菌群的16S rRNA基因进行了分析。结果发现，应激小鼠的肠道菌群组成发生了显著变化。最丰富的门是拟杆菌门、厚壁菌门和Campilobacterota(图2A)，应激小鼠中变形菌门和放线菌门的丰度明显高于非应激小鼠(图2B)。此外，应激小鼠与非应激小鼠之间有14个属的丰度存在显著差异：4个属(Parasutterella和Rikenellaceae_RC9_gut_group)的丰度增加，其余10个属(Bacteroides、Alistipes和Lactobacillus)的丰度降低(图2C，D)。此外，应激小鼠肠道微生物群的多样性(Chao1指数)显著下降(图2E)。然后，进行了线性判别分析效应量(LEfSe)分析，以确定差异改变的细菌类型。正如LEfSe图和进化分支图所示(图2F，G)，62个分类群(应激组30个，对照组32个)被确定为潜在的微生物标记。总体而言，这些结果表明心理应激对肠道微生物有显著影响。

图2. 心理应激对肠道菌群组成的影响(n = 6/组)。

(A)肠道菌群在门水平上的丰度；(B)组间门水平显著差异菌群；(C)肠道菌群在属水平上的丰度；(D)组间属水平显著差异菌群。对于图(B, D)，左图显示差异物种的丰度，右图显示95%置信区间。(E)对照组和应激小鼠粪便Chao1指数(P = 0.0345)；(F)通过LEfSe分析鉴定各组间的差异菌群；(G) LEfSe分析的进化分支图，代表了从门到属的分类水平。

3.“情感障碍菌群”的FMT增加了应激敏感性

为了研究肠道微生物群的变化是否与心理应激下情感障碍的发病机制有关，对心理应激小鼠来源的“情感障碍菌群”和非应激小鼠来源的“正常菌群”进行了FMT(图3A)。移植了微生物群的小鼠也接受了假治疗或心理应激。在FMT和心理应激治疗后第一天进行SPT、FST和OFT。FST结果显示，与移植“正常菌群”相比，移植“情感障碍菌群”进一步增加了小鼠本已较高的静止不动时间(图3C)。OFT结果显示，相对于“正常菌群”的移植，移植“情感障碍菌群”加剧了小鼠在开放区域中心停留时间的减少(图3D)。在SPT方面，移植了“情感障碍菌群”或“正常菌群”的应激小鼠对蔗糖的偏好下降，并且在移植了“情感障碍菌群”的小鼠中下降更为明显，但应激+FMT两组之间没有统计学差异(图3B)。

值得注意的是，与移植了“正常菌群”的小鼠相比，移植了“情感障碍菌群”的非应激小鼠在行为表现上没有显著变化。这些数据表明，来自心理应激小鼠的“情感障碍菌群”的FMT导致应激敏感性增加。

图3. “情感障碍菌群”的FMT对应激敏感性的影响。

(A)实验设计；(B)心理应激的FMT降低了蔗糖偏好性[F(1,36)= 4.515，P= 0.0405；F(1,36) = 14.6，P= 0.0005]，(C)“情感障碍菌群”的FMT增加了本已较高的不动时间[F(1,36) = 19.58，P< 0.0001]；(D)并加剧了小鼠在空地中心停留时间的减少[F(1,36) = 11.59，P = 0.0016]。数值代表平均值±SD；N = 10/组。采用Tukey事后检验的双因素方差分析来比较差异(与对照组相比：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；#p < 0.05，##p < 0.01)。

4.非靶向代谢组学分析

考虑到微生物代谢物在调节肠道微生物组和宿主病理生理中的关键作用，我们研究了由于微生物变化导致的心理应激对代谢物的影响。PLS-DA分析显示应激和非应激小鼠表现出独特的代谢物谱(图4A)。总体而言，鉴定出1000多种肠道代谢物，其中149种差异表达：118种下调，31种上调(图4B)。这些已在图4C中列出。KEGG通路分析表明，差异代谢物主要与α-亚麻酸代谢、味觉转导和半乳糖代谢相关(图4D)。这些结果表明，暴露于心理压力下的小鼠在粪便代谢物谱上表现出实质性的差异，这似乎有助于情感性障碍的发展。

图4. 粪便代谢组学分析显示应激小鼠和非应激小鼠的代谢物有显著变化(n = 5/组)；

(A) PLS-DA图显示各组间代谢物有显著变化；(B)火山图显示差异代谢物的总体分布(118个下调，31个上调)；(C)差异代谢物的热图；(D)基于显著改变的代谢物的KEGG通路分析。圆点颜色表示P，圆点大小表示相应通路中差异代谢物的数量。

5.相关性分析

通过Spearman相关分析来评估属水平上的差异细菌与差异代谢物之间的关系。几种代谢物显示与关键的肠道微生物群有很强的关系。图5A和图5B分别列出了前10个属和前20种代谢物，并以热图和弦图表示。在与16S rRNA分析差异显著的细菌属中，Alistipes和拟杆菌属(Bacteroides)主要与几种代谢物(2-羟基-2-甲基丁酸、十二烷二酸、犬尿酸)呈正相关，而Parasutterella呈负相关。

图5. 前10个差异菌属与前20种差异代谢物的相关性分析。

(A)热图相关分析。水平方向表示不同的细菌，垂直方向表示不同的代谢物，右边的图例表示相关系数；红色为正相关，蓝色为负相关；星号(*)表示有统计学意义(p < 0.05)。(B)弦图。节点代表不同的细菌属和代谢物。弦宽表示相关强度。弦边颜色表示相关性，红色表示正相关，蓝色表示负相关。  

讨论

据报道，生理和心理压力会对情绪行为产生负面影响。此外，不同的刺激方式对动物的影响也不同。在本研究中，作者建立了一个纯心理应激模型，其中小鼠暴露于慢性恐惧。SPT和FST结果显示心理应激小鼠表现出抑郁样行为，OFT结果显示它们表现出焦虑样行为。此外，与非应激小鼠相比，应激小鼠体重减轻。这些数据与之前的一项研究结果一致，证实了心理压力会诱发小鼠的情感障碍。 据报道，肠道微生物群通过“微生物-肠-脑轴”影响大脑功能和行为，肠道微生物组成的变化可能最终导致应激相关情感障碍的发病机制。先前的研究报道称，与健康对照组相比，抑郁症患者的微生物组成发生了变化，微生物多样性也较低。从抑郁症患者到无菌大鼠的FMT诱导了快感缺失和焦虑样行为。另一项研究发现，慢性不可预测的轻度压力会促进小鼠的焦虑和抑郁样行为，这与肠道微生物群组成的调节有关；此外，被应激小鼠肠道菌群定植的小鼠也表现出类似的行为。在本研究中，我们甚至发现将小鼠暴露于纯粹的心理压力下会显著影响肠道微生物群的组成，其特征是4个属的丰度增加，10个属的丰度减少。此外，与移植“正常菌群”相比，移植“情感障碍菌群”加重了心理应激引起的情感性障碍。值得注意的是，移植了“情感障碍菌群”的非应激小鼠在行为表现上没有明显的变化，这与以往的研究结果不同。在早期的研究中，研究人员发现将来自重度抑郁症患者的“抑郁症微生物群”植入无菌小鼠会诱发抑郁样行为。这些相互矛盾的结果可能是由于应激刺激模型的差异，而“情感障碍菌群”来源于应激刺激模型。本研究的结果表明，心理应激体验本身是产生情感障碍行为变化所必需的。然而，来自心理应激小鼠的“情感障碍菌群”的FMT导致应激敏感性增加。 微生物代谢物明显促进肠-脑通讯和行为调节，考虑到心理压力会影响特定肠道微生物群的丰度，我们下一步试图研究细菌衍生代谢物的变化。本研究的结果表明，应激和非应激小鼠表现出不同的代谢谱。心理应激小鼠α-亚麻酸代谢、味觉传导、半乳糖代谢明显紊乱。α-亚麻酸是动物和人类体内的一种主要的omega-3脂肪酸，对几种神经认知功能至关重要。据报道，omega-3脂肪酸水平的改变会降低对压力和情绪障碍的抵抗力。味觉转导通路也参与情绪调节；Dmitrzakk-Weglarz等人观察到，在女性单相抑郁症患者中，味觉转导通路下调。半乳糖对人体新陈代谢至关重要，除了在人体生理学中的广泛作用外，半乳糖代谢已被报道对几种疾病有益，特别是那些影响大脑功能的疾病。这三种生物学过程似乎与心理应激引起的情感障碍密切相关。此外，本研究还发现应激小鼠的色氨酸代谢与对照组不同。色氨酸及其代谢物(如血清素)和其他分解代谢物(如犬尿氨酸及其代谢物)具有神经活性，影响精神疾病的发展。最近的研究表明，肠道微生物群可以通过直接或间接的影响，以多种方式塑造色氨酸的代谢途径，调节宿主的生理和行为，包括免疫系统、胃肠道、代谢过程以及神经发育、焦虑和抑郁行为。这一课题值得进一步研究。 本研究还发现，在属水平上，各种代谢物与关键的肠道微生物有很强的关系。在差异显著的属中，Alistipes和拟杆菌属(Bacteroides)与几种代谢物(以有机酸为主，如十二烷二酸和犬尿酸)主要呈正相关，而Parasutterella与这几种代谢物呈负相关。Alistipes和Bacteroides与色氨酸代谢有关，可能导致犬尿酸和色氨酸衍生物N-乙酰-D-色氨酸代谢异常。十二烷二酸是一种偶数中链二羧酸，具有介于葡萄糖和脂肪酸之间的特性，其减少可能是由于肠道菌群对底物代谢的减少。因此，脂肪酸和色氨酸代谢可能参与了细菌易位过程中情感障碍的发生。 本研究也存在一些局限性。本研究结果表明，肠道微生物群的生态失调有助于心理应激反应的情感性障碍的发展，但尚未提供肠道代谢组改变的直接证据。更重要的是，哪些代谢物在改善心理应激下的情感障碍行为中起着最重要的作用，还有待研究。作者计划在未来的研究中重点关注这一点。 综上所述，心理压力会导致小鼠出现焦虑和抑郁样行为。此外，心理应激改变了肠道微生物多样性和代谢物谱，一些核心的差异细菌属与几种差异代谢物有很强的相关性。最后，来自心理应激小鼠的“情感障碍菌群”的FMT导致应激敏感性增加。总体而言，这些数据表明，肠道微生物群的改变可能与心理应激引起的情感性障碍的发展有关。

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