利用CRISPR相关转座酶实现大片段基因敲入

十年前，CRISPR-Cas系统正式进入大众视野，现在，这种RNA引导的DNA编程系统已经在基础研究、农业应用和疾病治疗中得到广泛应用[1]。在哺乳动物细胞中，CRISPR-Cas9介导的双链断裂（DSB）主要有两种修复方式——非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），而且NHEJ 的效率通常超过HDR至少一个数量级[2]；虽然科学家们努力利用不同的方法增强HDR效率来实现精准编辑，但对于基因组中大片段DNA的精确增删仍然效率低下且难以生成[3]，而伴随的大规模基因组缺失、染色体易位和染色体破碎等副作用也成为阻碍基因编辑发展的绊脚石[4]。      

基于CRISPR-Cas系统新型基因编辑工具，包括碱基编辑器（Base editor）和先导编辑器（Prime editor），利用失活的dCas9（或nCas9）实现基因组的精准定位，同时利用融合的效应蛋白在特定位点发生所需的化学反应，从而实现精确的、不依赖于DSB的DNA序列改变[2]。然而，这两种方法的高效编辑范围一般为从单碱基到~50个碱基对（bp），而无法实现大片段的整合。最近开发的将先导编辑器与丝氨酸整合酶相结合的工具，如TwinPE和PASTE，已被证明能够插入更大的 DNA，效率高达~25%，但这些方法需要在基因组整合位点发生多步有序的编辑事件，所以复杂DNA中间体的产生、各步反应的效率和顺序是否能协调一致，依然是亟待解决的问题[5-6]。

2023年3月29日，来自Columbia University的Samuel H. Sternberg团队在Nature Biotechnology上在线发表了题为Targeted DNA integration in human cells without double-strand breaks using CRISPR-associated transposases的研究文章。研究人员基于细菌CRISPR相关转座酶（CAST）可以在不诱导DSB的前提下催化大片段DNA整合入基因组的研究[7]，使用源自霍乱弧菌的Type I-F CAST系统，在哺乳动物细胞中实现了无DSB的DNA敲入。

源自霍乱弧菌的Type I-F CAST系统包含TniQ和级联复合物（Vch QCascade），TnsC,TnsA-TnsB异源二聚体，以及作为向导的crRNA（gRNA）。作者首先需要验证这些细菌蛋白和向导RNA是否可以在哺乳动物细胞内有效表达。通过将每个蛋白编码基因克隆到具有N端或C端核定位信号（NLS）和3×FLAG表位标签的表达载体上，无论是单独转染还是所有CAST蛋白共同转染，WB的结果均显示CAST系统蛋白的高效表达。之后，作者利用之前开发的方法，监测GFP编码mRNA的5’非翻译区（UTR）内的crRNA生物发生，从而单独评估了向导RNA的表达。作者将此系统命名为eCAST-1。

图1. CAST系统在人类细胞中的表达

与大多数II型和V型CRISPR-Cas系统编码的单个效应蛋白组成的DNA核酸酶（如Cas9和Cas12）不同，I型系统编码的级联复合体不具有DNA切割活性，反而类似于dCas9只具有结合DNA的功能；于是作者通过将转录激活因子与QCascade融合来构建新型转录激活系统，并在细胞内实现报告基因的转录激活。接着，作者根据先前的发现——TnsC可以形成ATP依赖性寡聚体，并被特异性招募到结合DNA的QCascade，假设可以利用TnsC多价组装的特性，以增加哺乳动物细胞中转录激活的效力，于是将VP64融合到TnsC的N端或C端，靶向报告基因位点，发现TnsC-VP64激活剂比单独的QCascade驱动更高水平的转录激活。  

图2. 基于QCascade和TnsC的转录激活工具 

之后，作者开始尝试在哺乳动物细胞中利用CAST系统进行基因敲入。作者首先在细胞中开展从供体质粒到受体质粒的基因转移，却发现源于霍乱弧菌的eCAST-1系统进行的质粒间整合的绝对效率普遍低于0.1%。为了提高效率，作者利用相同的方法对新鉴定出的18种CAST系统进行筛选，以期获得活性更高的工具。经过分层筛选，作者发现，仅有来自假交替单胞菌属的系统（eCAST-2.1）在细胞中的活性比eCAST-1高约40倍；通过调整crRNA的设计、NLS标签的位置和每个表达质粒的相对数量，活性进一步提高了约6倍，达到3-5%的整合效率，整合位点在目标下游49 bp。由此，作者得到了eCAST-2.2系统。  

图3. 在细胞内筛选高活性的CAST系统

在使用eCAST-2.2实现质粒间的基因转移后，作者利用eCAST-2.2尝试将大片段DNA敲入细胞基因组，针对包括AAVS1在内的九个位点，作者分别设计1-3条crRNA，并检测到整合效率各不相同，但通常约为 0.01%，作者认为效率的降低可能和转座后CAST复合物的不完全解离有关，因为这可能导致复制叉停滞或者类似于链间交联诱导的DNA修复。于是，作者在体系中引入ClpX蛋白，一种序列特异性AAA+ ATP酶来实现转座后复合物的解离，尽管可观察到的ClpX诱导的细胞毒性，但基因组整合效率以 ClpX 剂量响应方式增加了约 100倍，由此得到了eCAST-3系统。    

图4. ClpX增强基因组整合效率

总之，作者开发了一种使用Type I-F CAST在人类细胞基因组中整合大片段DNA序列的方法，该方法避免了DSB的产生，也规避了同类技术的缺点，未来的改进将集中于提高基因整合的效率和精度。

参考文献   [1] Pickar-Oliver, A. & Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR–Cas technologies and applications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.20, 490–507 (2019). [2] Anzalone, A. V., Koblan, L. W. & Liu, D. R. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat. Biotechnol. 38, 824–844 (2020). [3] Maruyama, T. et al. Inhibition of non-homologous end joining increases the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing. Nature 33, 538–542 (2015). [4] Heyer, W.-D., Ehmesn, K. T. & Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 44, 113–139 (2010). [5] Anzalone, A. V. et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat. Biotechnol. 40, 731–740 (2021). [6] Yarnall, M. T. N. et al. Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases. Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01527-4 (2022). [7] Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019). 

作者：Tony 编辑人：Transparent 来源： 医药速览 2023-04-03