快报 | MeltPro和二代测序技术在耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮耐药检测性能的比较

作者：胡彦，池雨晴, 冯鑫，余锋平，李浩然, 尚媛媛，潘军华，逄宇

第一作者及单位：胡彦，重庆市结核病防治所

通信作者及单位：潘军华和逄宇，首都医科大学附属北京胸科医院

Comparison of the Diagnostic Performance of MeltPro and Next-Generation Sequencing in Determining Fluoroquinolone Resistance in Multidrug-Resistant Tuberculosis Isolates.

Hu Y, Chi Y, Feng X, Yu F, Li H, Shang Y, Pan J, Pang Y.

J Mol Diagn，2023 ，25(6):342-351.

doi: 10.1016/j.jmoldx.2023.02.003.

PMID: 37208048.

研究背景

耐药结核病，尤其是耐多药结核病 (MDR-TB) 是全球消除结核病进程中的主要障碍。2020年，世界卫生组织（WHO）估计约有50万例利福平耐药/MDR-TB (RR/MDR-TB) 患者。尽管MDR-TB仅占全球结核病负担的5%，但其占结核病死亡率的近12%。据估计，仅约50%的MDR-TB患者在疗程结束后可转阴。因此，早期诊断MDR-TB并合理用药对于降低死亡率至关重要。氟喹诺酮类药物（FQs）是MDR-TB治疗的核心药物。经验性使用FQs治疗呼吸道感染加速了对FQs耐药结核病的发生。近期研究显示，最近几十年，中国FQs耐药比例从3.0%急剧上升至7.7%，主要是由于FQs在呼吸道感染中的滥用。因此，在结核病和耐药结核病高发地区，对这些药物耐药性的鉴定极为重要。然而，二线药物敏感性试验（简称“药敏试验”；DST）在全球范围内可及性很差，仅1/3的RR/MDR-TB患者进行了二线药物的DST，因为表型DST价格昂贵、耗时，且对生物安全有专门要求。

分子药敏试验对耐药结核病的临床高效管理优势明显。结核分枝杆菌对FQs耐药的主要机制是DNA解旋酶相关基因的突变。DNA解旋酶是由gyrA和gyrB基因编码的2个A亚单位和2个B亚单位组成的四聚体。通过检测gyrA和（或）gyrB的FQs耐药决定区(QRDR)相关突变，可以快速检测多数FQs耐药株，敏感度约为85%。已有多个自动化分子检测平台可以快速检测FQs耐药性，包括GeneXpert MTB/XDR、GenoType MTBDRsl和MeltPro MTB/FQ检测系统。尽管基于PCR的诊断技术有很大进展，但对低频率的异质性耐药检测仍不够理想。

2018年，WHO推荐了二代测序技术（NGS）用于快速检测耐药结核病相关突变。NGS可对异质性耐药进行更准确的鉴定，可检测到1%的耐药菌，与表型DST相当。本研究系统地比较了荧光PCR熔解曲线法（MeltPro）和NGS两种方法对MDR-TB患者FQs耐药的诊断性能，也探讨了基因突变与FQs表型耐药水平的关系。

研究方法

收集2019年3月至2020年6月从重庆市各区县送至重庆市结核病防治所的分枝杆菌培养阳性分离株，经比例法药敏试验后采用简单随机抽样方法选取MDR-TB分离株126株。分别采用微量肉汤稀释法、Sanger测序、MeltPro和NGS对FQs进行表型药敏试验和分子药敏试验。最近的一项临床研究发现，疗效差与异质性药耐药>1%相关，因此，本研究全基因组测序（WGS）以1%作为异质性耐药的检出限(LOD)。从结核病信息管理系统（TBIMS）中收集患者的人口社会学和临床特征。分别以表型药敏试验及检测组合（将Sanger测序有gyrA突变但表型药敏试验检测为敏感株归为耐药组，将有gyrB突变且gyrA为野生型者归为敏感组）为金标准，评价MeltPro和NGS对FQs耐药的检测性能。对氧氟沙星（Ofx）耐药和敏感株间的不同人口社会学和临床特征差异的比较采用卡方检验；不同突变株间最低抑菌浓度（MIC）分布的差异比较采用Kruskal-Wallis检验；以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

研究结果

一、对Ofx耐药的结核分枝杆菌分离株的一般特征

126例MDR-TB患者中，男性87例（69.0%），复治81例（64.3%），Lineage 2基因型106例（84.1%）。在对Ofx耐药和敏感的菌株中，卡那霉素的耐药率分别为27.9%和2.5%，阿米卡星的耐药率分别为19.8%和2.5%，相比对二线注射类药物敏感的患者，对二线注射类药物耐药的患者更容易发生Ofx耐药（表1）。

二、以表型DST为标准，MeltPro和WGS的检测性能

以表型DST为金标准，MeltPro和WGS检测Ofx耐药的敏感度分别为95.3%和96.5%，特异度分别为90.0%和82.5%（表2）。1株异质性耐药比例为15.3%的Ofx耐药株，被WGS检测到而MeltPro未检出。此外，3株比例法表型DST检测为Ofx耐药株，未检出任何gyrA/B突变，其MIC范围为1.0～4.0 mg/L。4株经MeltPro检测为对Ofx耐药的菌株，表型DST显示为敏感，WGS测序结果显示该4株菌株均存在gyrA基因突变，其中Ala90Val 3株，Asp94Ala 1株。其余3株被WGS错误地鉴定为耐药的菌株均存在gyrB突变；其中，2株突变发生在gyrB基因 QRDR区外（密码子461～499）。体外MIC检测结果显示，这些gyrB突变株的MIC范围在1.0～2.0 mg/L之间，表明gyrB突变与Ofx耐药不相关（表3）。

三、FQs的MIC值与gyrA/B突变的相关性

126株MDR-MTB分离株中，88株存在gyrA基因QRDR区突变，以gyrA 94位密码子突变为主(61株, 69.3%)，其中Asp94Gly34株 (38.6%)、Asp94Ala 14株(15.9%)、Asp94Asn 8株 (9.1%)、Asp94Tyr 5株(5.7%)。Ala90Val突变率为31.8%（28/88），居第二位。此外，9株MDR-MTB分离株存在gyrB突变，gyrB QRDR区的Asp461Asn突变最为常见（4株, 4.4%）。18株 (20.5%) MDR-MTB分离株QRDR区存在双位点突变，其中12株 (13.6%) 发生gyrA双位点突变，6株 (6.8%) 同时存在1个gyrA位点突变和1个gyrB位点突变。

携带gyrA主要突变类型分离株的MIC分布见图1。gyrA基因QRDR区突变的88株分离株大多对FQs耐药，其中85株（96.6%）对Ofx耐药，84株（95.5%）对左氧氟沙星（Lfx）耐药、81株（82.0%）对莫西沙星（Mfx）耐药，但有20株(22.7%)对加替沙星敏感。携带gyrA突变的分离株对Ofx耐药水平取决于氨基酸改变类型。其中，Asp94Asn、Asp94Gly和Asp94Tyr与Ofx高水平耐药相关(MIC>4 mg/ml），而Ala90Val和Asp94Ala与Ofx低水平耐药(MIC≤4 mg/ml）或敏感有关，也是加替沙星敏感的主要突变型。

进一步探讨gyrB突变与Ofx的MIC之间的关系，发现仅有gyrB突变株的MIC为2 mg/L，仅携带Ala90Val突变株的MIC值也较低，接近耐药临界值(中位数为4 mg/ml)，但两者联合突变株对Ofx的MIC值较仅Ala90Val突变株高8倍(中位数为32 mg/ml，P=0.038)(图2)。

四、异质性耐药

MDR-MTB分离株DNA旋转酶A亚基异质性耐药的具体比例见图3。WGS测序结果显示，在88株gyrA QRDRs区突变株中，12株(13.6%)存在异质性耐药，异质性耐药的比例为15.3%~89.4%。进一步比较不同分子检测方法对异质性耐药的最低检出限，结果显示Sanger测序和 MeltPro法的最低检出限分别约50%和20%。

五、以表型DST为标准，MeltPro和WGS的检测性能

考虑到gyrB QRDR区外的突变对耐药的预测价值较低，4株具有该突变的分离株被归为敏感组。3株有gyrA突变但对Ofx表型敏感的分离株被归为耐药组。以该修正后的复合金标准为参照，MeltPro和WGS检测的敏感度（95%CI）分别为95.6%（88.4%～98.6%）和96.7%（89.9%～99.1%），特异度（95%CI）均为100.0%（94.7～100.0）。

研究结论

MeltPro和WGS可以正确检测由gyrA QRDR区突变引起的FQs耐药。低水平耐药相关的gyrA Ala90Val突变联合gyrB Asp461Asn突变可明显降低体外检测FQs的敏感性，尚需进一步对FQs和发生突变的DNA旋转酶复合体进行结构分析来验证该假设。

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供稿：胡    彦

编辑：孟    莉

审校：范永德

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