重磅科研丨Cell(IF:64): 癌症患者药物、微生物组和死亡率之间关联的高分辨率分析

编译：微科盟蔚蓝

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

识别药物暴露对癌症患者肠道细菌群落的影响具有挑战性。本研究通过开发和应用一种新的计算方法PARADIGM(与肠道微生物群动态相关的参数)，分析接受异基因造血干细胞移植(allo-HCT)患者的大量纵向粪便微生物组谱以及详细用药记录，揭示了药物暴露与微生物组成变化之间的关系。本研究观察到几种非抗生素药物(包括泻药、止吐药和阿片类药物)与肠球菌(Enterococcus)相对丰度增加和α多样性降低有关。鸟枪法宏基因组测序进一步证明了亚种竞争，导致allo-HCT期间优势菌株遗传趋同增加，这与抗生素暴露显著相关。本研究整合了药物-微生物组关联，仅基于药物暴露来预测两个验证队列的临床结局，表明这种方法可以对药物暴露如何干扰或维持微生物组组成产生生物学和临床相关的见解。综上所述，本研究将一种称为PARADIGM的计算方法应用于癌症患者纵向粪便样本和详细每日用药记录的大型数据集，揭示了药物暴露与肠道微生物群之间的关联，这些关联概括了体外研究结果，并可以预测临床结局。

图文摘要

论文ID

原名：High-resolution analyses of associations between medications, microbiome, and mortality in cancer patients

译名：癌症患者药物、微生物组和死亡率之间关联的高分辨率分析

期刊：Cell

IF：64.5

发表时间：2023.6

通讯作者：Marcel R.M. van den Brink

通讯作者单位：美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心

DOI号：10.1016/j.cell.2023.05.007

实验设计

结果

1. 聚类捕捉allo-HCT期间肠道微生物组的时间动态

该数据集由来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC；图1；表1)的1201名allo-HCT患者的9167份粪便样本组成。本研究将MSKCC队列分为发现队列(7454个样本；778名患者)和验证队列(1713个样本；423名患者)(图1;及表1)。利用Bray-Curtis β多样性相异性指数计算发现队列样本之间在属水平(16S rRNA测序样本)和种水平(鸟枪法宏基因组测序样本)上的组成差异，并通过t-分布随机近邻嵌入(tSNE)对高维粪便组成数据进行可视化(图2A和2B)。

图1. 发现和验证队列患者的选择标准。MSKCC发现队列被纳入测序数据聚类和PARADIGM算法训练集。验证队列被纳入临床结局分析。

表1. 来自MSKCC和Duke的患者和样本队列。

本研究观察到微生物组损伤的模式，包括α多样性的丧失和潜在致病细菌(如肠球菌属Enterococcus和肠杆菌科)的富集(图2A和2B)。正如在allo-HCT患者中所充分描述的那样，这些支配事件可能影响深远，以至于粪便样本中单个分类单元相对丰度占比>90%，并可预测特定的有害临床结局，例如血源性感染、移植物抗宿主病(GVHD)和死亡。具有鸟枪法宏基因组分析结果的980个样本子集在allo-HCT期间也具有类似的微生物组损伤模式(图2B)。确切地说，我们发现一组样本中最丰富的微生物是各种严格厌氧菌，如Ruminococcus gnavus或Erysipelatoclostridium ramosum，以及富集潜在致病兼性物种的不同集群，包括屎肠球菌Enterococcus faecium、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae和大肠杆菌Escherichia coli。 与健康人群中更具流动性和非离散的微生物群相比，allo-HCT患者中可重复观察到的微生物组扰动提供了独特的机会来了解环境暴露下相对不同的扰动微生物组组成或状态的动态和演变。鉴于在维持细菌群落结构的同时降低维度复杂性的数学挑战，我们对发现数据集中样本的Bray-Curtis β多样性矩阵进行了无监督k-means聚类分析，并鉴定了10个不同的微生物群聚类(图2C)。作者还探索了包括分层聚类(图S1A-S1C)和Dirichlet多项式混合等其他聚类方法，(图S1D-S1F)。由于k-means聚类可更均匀地划分样本(图S1G)，使用k-means聚类进行后续分析。 毛螺菌科和梭菌目是健康人体肠道中的主要共生类群，通常在聚类1-3中观察到，它们也具有高α多样性(与发现队列的多样性中位数相比)(图2D-2F)。聚类7-10代表低多样性的“生态失调”状态(图2D-2F)。肠道以单一细菌微生物(相对丰度≥30%)为主导是严重肠道生态失调的标志。乳杆菌属Lactobacillus、变形菌门和链球菌属Streptococcus在聚类5、8和9的样本中高度富集。聚类7和10由以肠球菌属Enterococcus为主的样本组成，聚类10特异性富集E. faecium(图2D和2E)。这些组成簇也捕获了allo-HCT期间肠道微生物群的时间动态：高多样性聚类1-3在allo-HCT前常见，而低多样性状态(尤其是聚类7-10)在allo-HCT后更为常见(图2G)。 将样品分类为离散的微生物组状态使我们能够将微生物群落的复杂变化建模为聚类转换概率。相对于HCT，我们观察到在第-16天和第1084天之间间隔最多7天采集的连续样本的转换概率。在2987对(54.5%)样本中，患者在连续两个样本中维持在同一聚类中(图2H；表S1)。与高度稳定的8-10等优势聚类相比(平均频率65.1%；SD 14.1%)，在连续样本中患者维持在高多样性聚类1-3中的可能性较小(平均频率46.4%；SD 5.0%)。我们发现聚类α多样性与自转换概率之间存在显著负相关关系，这表明与低多样性聚类相比，高多样性聚类的稳定性较差(图S1J)。在2495对样本(45.5%)中观察到了从一个聚类到另一个聚类的转变。

本研究发现Enterococcus-high聚类10具有极强的稳定性，由于该细菌属与HCT后不良临床结果的关联，这一点令人感兴趣。为了研究肠球菌属优势稳定性的潜在驱动因素，作者开发了一个逻辑回归模型，使用lasso惩罚分析聚类10的稳定性作为参数的函数，包括抗生素暴露、样本收集时间、α多样性和聚类10中最丰富的前20个属的相对丰度。将该模型应用于相对于HCT在-14至100天之间收集的每日样本配对数据集，发现葡萄球菌Staphylococcu和Erysipelatoclostridium的相对丰度较高与聚类10的稳定性降低有关(图S1K)。另一方面，相对丰度较高的肠球菌属与聚类10的稳定性增加有关，表明肠球菌的优势导致支持其自身稳定性的正反馈循环。正如预期的那样，抗生素暴露与聚类10稳定性的增加有关。本研究使用真实世界的数据，发现药物暴露等环境因素和细菌之间的生态关系都有益于微生物群落的稳定性，特别是关于肠球菌属的优势。

图2. allo-HCT患者的肠道微生物群是高度动态的。

(A和B)通过tSNE投影可视化的MSKCC发现队列中肠道微生物群的组成空间。每个点代表一个样本，根据(A) 16S rRNA(7454个样本；778名患者)或(B)鸟枪法宏基因组测序图谱(980个样本；340名患者)(p：门；f：科；o：目；g：属)中相对丰度最高的分类群着色。在相对于HCT的-30和2205天之间收集样本。(C)通过k-means无监督聚类方法分配10个肠道微生物组组成簇。(D和E) MSKCC发现队列中16S rRNA谱中最常见的前20个属(D)和鸟枪法宏基因组谱中种(E)的相对丰度。每列为一个样本；每行是一个属或种。行通过分层聚类进行聚类。(F)聚类α多样性。水平虚线表示MSKCC发现队列的中位数α多样性。(G)相对于HCT随时间变化的聚类相对频率。(H)描绘10个肠道微生物群聚类随时间变化的网络图(5482对后续样本；677名患者；相对于HCT在-16至1084天之间收集样本)。

2. allo-HCT期间的非抗生素暴露与肠道微生物组组成的变化有关

为了研究药物暴露与微生物组聚类转换之间的关联，我们开发了PARADIGM，这是一种基于逻辑回归模型整合一阶马尔可夫链转换的计算工具。马尔可夫链模型以前已被用于研究微生物组动态，但马尔可夫转换与环境因素之间的关联尚未得到广泛研究。该模型利用高分辨率的每日16S rRNA测序粪便样本(2039个样本对；454名患者；表S2)推断药物暴露与聚类转换之间的关系(图3A)。对于每个聚类，我们定义了两种转换类型：自转换(患者维持在同一聚类中)和吸引转换(患者移动到给定聚类)。“自转换”和“吸引转换”的命名源于其所传达的关于本研究中聚类动态的直观内涵。在一对每日收集的样本中，自转换描述了给定聚类保持其当前状态的概率，而吸引转换描述了给定聚类从除自身以外的任何聚类接收转换的概率。 本文重点研究了发现队列患者经常接触的62种药物。为确定每种药物对自转换和吸引转换可能性的贡献，我们使用了弹性网逻辑回归，其中每种药物的所得系数表明了药物与每日聚类转换之间关联的方向和大小。相对于HCT，allo-HCT中的微生物组损伤模式与时间密切相关。因此，我们将时间作为协变量来明确药物暴露的时间模式，并减弱微生物组聚类动态中的时间依赖性变异性(图S2)。为了解释患者在训练集数据点中的不同等贡献(表S2)，我们在训练队列中预先指定了10倍交叉验证分区，使同一患者的样本始终位于同一分区中。 本研究确定了药物暴露与聚类自转换和吸引转换之间的几种关联(图3B；完整结果见图S3)。正如预期的那样，用于经验性治疗中性粒细胞减少性发热的几种抗生素与肠道微生物群的复杂变化有关。暴露于美罗培南(增加2.5倍)和甲硝唑(增加3.4倍)与向Enterococcus-high聚类10的转换增加有关，这与既往研究一致。几种非抗生素药物也与特定的聚类动态相关。暴露于阿瑞匹坦(一种用于化疗引起的恶心的速激肽受体拮抗剂)与向Enterococcus-high聚类10的转换频率增加2.8倍有关(图S3)。同样，暴露于阿片类镇痛药芬太尼与向Enterococcus-high聚类10的转换频率增加1.9倍有关。未知靶向肠道细菌的其他药物(如拉贝洛尔和胰岛素)与Enterococcus-high聚类10的稳定性降低有关(图S3)。总之，PARADIGM确定了几种非抗生素药物与肠道微生物组变化之间的关联。

先前的研究已经确定了与接受allo-HCT后的临床结局具有有益或有害关联的特定细菌。因此，通过计算细菌反应评分，我们将药物-聚类关联转化为药物-分类群关联，进而识别药物暴露与具有临床意义的特定分类群变化之间的关联(图3C；完整结果见图S4)。在本研究的模型中，细菌反应评分估计药物暴露与微生物组特征(即分类群的相对丰度或α多样性)之间的关联，其中正评分表明与较高的相对丰度或多样性值相关(图3A)。我们重点关注既往与allo-HCT患者结局相关的四种微生物组特征，即肠球菌属、布劳特氏菌属Blautia、Erysipelatoclostridium的相对丰度和α多样性。该队列中用作经验性或病原体定向治疗的大多数抗生素(甲硝唑、美罗培南、氨曲南和头孢吡肟)均与肠球菌属相对丰度增加以及α多样性降低有关，这与之前的研究结果一致(图3C和S4)。我们观察到头孢吡肟暴露与肠球菌属的扩增有关，这与我们之前的报告一致。可能部分解释了头孢吡肟和其他头孢菌素对肠球菌的活性较差。与其他经验性抗生素相比，哌拉西林-他唑巴坦暴露与肠球菌属相对丰度降低以及肠道共生菌(如Blautia和Erysipelatoclostridium)的相对丰度降低具有更大程度的相关性(图S4)。我们还观察到，与肠球菌扩增最密切相关的药物是非抗生素药物，包括阿片类药物(如芬太尼和氢吗啡酮)、激素(如左旋甲状腺素)以及抗惊厥药(如加巴喷丁)(图3C和S4)。在未接受抗生素治疗的ICU患者中，既往研究显示阿片类药物暴露与Blautia相对丰度的降低有关，本研究还发现了芬太尼和氢吗啡酮的观察结果(图S3)。相比之下，多库酯和聚乙二醇等通便药与肠球菌属相对丰度的降低密切相关(图3C)。先前的实验研究表明，聚乙二醇通过调节肠道渗透压或通过直接抗菌抑制作用诱导小鼠细菌组成的整体变化。总体而言，与α多样性维持相关的药物暴露与肠球菌属扩增的减少相关，反之亦然(图3D)。  

图3. PARADIGM预测药物暴露后微生物组特征的改变，如属相对丰度和α多样性。

(A)PARADIGM的示意图，该算法利用每日采样16S rRNA测序样品和聚类转移来推断药物暴露与微生物动态的关系。细菌反应评分将药物-聚类关联转化为药物-属关联。(B)药物暴露与微生物组聚类动态之间的关联。TMP-SMX，磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶；ATG，抗胸腺细胞球蛋白。(C)细菌反应评分预测了给定药物暴露与属相对丰度或α多样性变化之间的关系。(D)肠球菌反应评分与α多样性反应评分之间的Pearson相关性。每个点代表一种药物。(E)细菌反应评分与体外抑制测量之间的Pearson相关性。每个点代表一个独特的药物-物种对之间的关联。(F)通过体外抑制预测细菌反应评分。双侧Wilcoxon秩和检验。

3. 根据独立体外数据集验证真实世界患者数据集的计算机结果

本研究通过比较来自癌症患者的“真实世界数据”与独立发表的体外数据，对PARADIGM的预测能力进行了测试(图3E-3F)。体外筛选与本研究共有19种细菌和34种药物。在图的左下象限可观察到具有体外抑制作用的药物-物种对(抗生素和非抗生素)富集，这对应于计算机结果中的负反应评分(Fisher精确检验：odd ratio=0.60，p=0.01)。此外，与体外未显示抑制作用的药物-物种对相比，在患者数据集中具有体外抑制作用的药物-物种对的反应评分显著降低(图3F)。综上所述，这些结果表明PARADIGM可以精准预测抗生素和非抗生素的体外抗菌活性，并区分药物与细菌物种的直接相互作用以及促使这些药物暴露的临床症状的潜在混杂影响。

4. 抗生素暴露是亚种动态的有力预测因素

几项实验研究表明，即使在同一属内，几种药物的杀菌谱也具有物种和菌株特异性。因此本研究使用来自MSKCC发现队列中具有可用鸟枪法宏基因组测序谱的340名患者的980个标本子集，探索了药物暴露与allo-HCT中具有临床意义的属内物种相对丰度变化之间的关系(图S5)。通过应用线性混合效应回归模型，我们确定了药物暴露与细菌物种相对丰度变化之间的关联。同样，我们检测到了不同药物类别(抗生素、泻药、止泻药和阿片类药物)的几种药物暴露与Blautia coccoides、Blautia producta、粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌和Erysipelatoclostridium ramosum的相对丰度变化有关，虽然这些关联没有统计学意义。

在人体肠道微生物群落中，大多数物种由单一优势菌株代表，尽管此前我们在allo-HCT患者中观察到E. faecium占主导地位期间的复杂菌株动态。针对3个感兴趣属中的5个物种，我们使用StrainPhlAn算法基于标记基因多态性确定了优势菌株的序列特征，并计算了连续患者样本中优势菌株之间基于树的系统发育距离(图4A，上半部分示意图)。连续样本中菌株之间的小系统发育距离表明优势菌株趋同，而大距离表明优势菌株随时间推移而分化。对于大多数物种，尤其是E. faecium，连续样本间的系统发育距离随着时间的推移而下降(图4A，中间行)。这种时间模式表明随着时间的推移，多个物种的物种内遗传变异性减少，而优势亚型兴起。此外，亚型变异性与物种相对丰度呈负相关(图4A，下行)。这种相关性可能是相对更适合菌株经所谓“选择性扫描”的结果，或者是因为allo-HCT期间可能发生的种群瓶颈而导致的变异性丢失。从allo-HCT患者纵向粪便样本中分离出的万古霉素耐药E. faecium中观察到遵循抛物线适应性景观的亚种多样化，这种专注于优势菌株的菌株分类方法可能无法捕获。我们观察到抗生素暴露是E. faecium物种内优势菌株遗传趋同的重要预测因子，而非抗生素暴露则不是(图4B和4C)。

图4. allo-HCT期间抗生素是菌株遗传趋同的有力预测因子。

(A)相对于HCT(中行)或物种相对丰度(底行)，随时间推移的菌株趋同。每个点代表在一对随后收集的样品中给定物种优势菌株之间基于树的系统发育距离。较高的系统发育距离表明遗传差异，而较低的系统发育距离表明菌株遗传相似。(B和C)抗生素暴露(B)与E. faecium优势菌株趋同增加有关，而不是非抗生素暴露(C)。每个点代表一对随后收集的样品中E. faecium优势菌株之间的系统发育距离。

5. 药物-微生物组关联可预测allo-HCT后未来的微生物组轨迹和临床结局

已经证明药物暴露与微生物群变化的相关性，鉴于先前将粪便微生物组成与allo-HCT临床结局相关联的研究，我们随后调查了单独的药物暴露模式是否可以独立于微生物组数据预测死亡率。使用来自单独MSKCC验证队列的药物暴露数据，我们将患者特异性反应评分定义为量化微生物组特征对药物暴露概况净反应的指标(图5A)。例如，患者特异性肠球菌反应评分将患者药物暴露概况转化为肠球菌属扩增的相对风险(图5B)。我们在两个独立验证队列中测试了这些患者特异性细菌反应评分与全因和特定原因死亡率的结果，这两个独立验证队列包括423名MSKCC患者的子集(未入组PARADIGM训练队列)，以及来自杜克大学医学中心的142名患者组成的独立队列。MSKCC验证队列考虑了所有62种药物暴露，而Duke验证队列仅评估了抗生素暴露。表2概述了这两个队列的患者特征。 本研究发现，在MSKCC和Duke验证队列中，基于药物暴露的患者特异性细菌反应评分(相对于HCT的-14至14天)分别与收集的样本中观察到的分类群相对丰度和α多样性显著正相关(相对于HCT的14至45天)(图5C)。此外，在MSKCC和Duke验证队列中，药物暴露特征预测肠球菌属扩增较高的患者在allo-HCT后发生全因死亡和移植相关死亡的风险增加。具体而言，在MSKCC验证队列中，患者特异性肠球菌反应评分也与GVHD相关死亡风险的增加显著相关(图5D)。相反，在MSKCC发现和验证队列中，药物暴露预测Eryispelatoclostridium、布劳特氏菌属或α多样性维持的患者全因死亡风险降低，在MSKCC验证队列中GVHD相关死亡率风险降低(图5D和S6B)。总体而言，本研究证明了药物-微生物组关联可以预测暴露后肠道微生物组组成的后续变化以及allo-HCT患者的临床结局。

该分析框架假设药物暴露会影响肠道微生物群，从而影响临床结局。但在某些情况下，不良结局风险高的患者(由于与微生物组无关的各种原因)可能已经接受了影响肠道细菌的药物治疗。为了探索这些可能性，我们聚焦于肠球菌属，并在Cox比例风险比模型中比较了肠球菌相对丰度的风险比与相应的患者特异性反应评分。我们报告了肠球菌属丰度与死亡风险之间的显著相关性，这比患者特异性肠球菌反应评分与总死亡率之间的相关性更强，特别是在MSKCC验证队列中(图S6C)。然而，我们还观察到，当控制肠道微生物组组成时，患者特异性反应评分仍然是死亡风险的统计学显著预测指标(图S6C)。总之，这些结果表明，药物暴露与临床结果之间的关联部分取决于药物与肠道微生物群的相互作用。

图5. 在两个不同的验证队列中，药物暴露情况可预测未来的微生物组轨迹和allo-HCT患者结局。

(A)患者特异性细菌反应评分计算示意图。(B)验证队列中患者特异性肠球菌反应评分仅基于图3C中所示的药物暴露概况和细菌反应评分得出。负值表示药物暴露与肠球菌抑制作用相关，而正值表明药物暴露与肠球菌促进作用相关。(C)在MSKCC验证队列(423名患者)和Duke队列(142名患者)中，患者特异性细菌反应评分与14至45天之间收集的样本中观察到的属相对丰度或α多样性之间的Pearson相关性。经Benjamini-Hochberg校正调整p值。(D) MSKCC和Duke验证队列中，患者特异性细菌反应评分可预测总体死亡率和病因特异性死亡率，在各自的多变量Cox比例风险或Fine-Gray模型中控制年龄、性别、移植物来源和潜在疾病。经Benjamini-Hochberg校正调整p值。误差条表示95%置信区间。

表2. 来自MSKCC和Duke队列的患者特征。

讨论

本研究开发了PARADIGM，这是一种可以识别药物暴露与人体肠道微生物动态间关联的计算方法。PARADIGM的核心是分析肠道微生物组成的离散状态如何对抗生素和非抗生素药物做出反应。尽管其他计算方法主要集中在抗生素上，我们的方法通过分析allo-HCT患者每日粪便样本的大型数据集，进一步以高分辨率揭示了许多非抗生素药物与微生物动态之间的关联。 本研究的方法能够推断药物暴露与微生物组之间有意义的关联，尽管存在各种混杂因素，例如促使这些药物暴露的临床症状，这在分析用于治疗肠道毒性的药物时尤为重要。本研究通过比较来自真实患者研究的细菌反应评分与已发表的体外观察结果来验证本研究的结果，并发现我们的估计值与报告的数据显著相关。此外，仅基于患者药物暴露计算的细菌反应评分使我们能够在两个独立的验证队列中预测未来的微生物变化和患者结局，特别是肠球菌反应。这些结果表明，PARADIGM可以产生具有生物学和临床相关性的假设。 综上所述，本研究提供了移植早期药物暴露与肠道微生物组成变化之间关联的见解。作者开发的算法PARADIGM确定了药物暴露与人类肠道微生物动态之间具有生物学意义和临床相关性的关联。PARADIGM有助于整合多种外源性药物的药物暴露、微生物组动态和临床结局，以了解微生物组健康的决定因素。该计算框架非常适合纵向数据，未来可将其应用于研究其他感兴趣的环境参数，例如“暴露组”的饮食摄入量或其他成分，或应用于药物-微生物组相互作用具有重要临床意义的其他疾病环境。本研究也存在一些局限性。本研究能够使用高通量方法识别药物-微生物组关联，并显示了这些关联在预测临床结局方面的能力。

但仍存在重要的局限性，应谨慎解释结果。

(1)本文分析了一项回顾性队列研究，需要对照实验来确认我们的预测是否有因果关系。

(2)药物-微生物组相互作用可能依赖于药物剂量，本研究并未考虑到这一点。

(3) 虽然已有协同和拮抗药物相互作用的报道，但我们的模型假设药物相互独立作用。

(4)本研究的模型并未完全捕捉到移植特异性效应。我们假设这些影响被时间参数和依赖于移植类型和预处理药物治疗方案部分减弱。

(5)药物暴露只是患者所遭受的各种扰动中的一个组成部分。其他环境因素也与肠道微生物组的变化有关。

例如，饮食摄入已被证明在塑造健康个体和癌症患者的肠道微生物群方面发挥重要作用。未来收集饮食摄入数据的研究可能有助于进一步阐明饮食、肠道微生物群变化和allo-HCT患者临床结局之间的关系。最后，我们设想PARADIGM是研究体内微生物组动态的有价值的工具，并等待其应用于其他可比较的数据集，包括药物暴露和其他环境因素，以重现和扩展本研究的结果。

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