药敏试验（二）

纸片扩散法

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。

这个平板也不是一般的平板，而是MH平板专门做药敏的。

这个MH平板的厚度也是有标准的厚4mm。

贴药敏纸片时，纸片与纸片之间，纸片与边缘之间都是有标准的

大家看这种，就是不行呀，贴的太密，根本量不了抑菌圈试验失败。

药敏试验操作步骤：

1.培养基：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，M-H）琼脂，厚4mm，pH7.2.
2.抗菌药物纸片：各纸片中心距离＞24mm，纸片距平板内缘应＞15mm。
3 菌液浓度：浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于1.5X108CFU/ml 4 受检菌液须在15min内接种完毕 具体操作步骤（临床）

1挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。

【注意事项】：

挑取菌落时，需要多挑几个菌落，每个菌落可以都挑半个，也需要多挑几个菌落。因为如果只挑一个菌落，有可能这个菌落正好出现某种耐药质粒的丢失，你做出来是敏感的，实际上是耐药的。多挑几个菌落，能最大程度上避免此种事情的发生。

正如下图所示。此图来源于胡付品老师的课件。

2用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；

3.然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；

4.最后沿平板内缘涂抹1周；

5.平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。

67.35℃孵育16～24小时量取抑菌圈直径；

7.根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。

纸片扩散法的影响因素

接种菌量

细菌生长率

抗生素含量、扩散性

平皿厚度

温度，预孵育时间