科研丨J HAZARD MATER: 抗生素混合物暴露对硝化微生物组功能紊乱的影响

编译：微科盟咖啡里的茶

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

本研究定量确定了由暴露于单一土霉素(OTC)和含有OTC和磺胺甲恶唑(SMX)的两种抗生素混合物所引起的硝化微生物组功能紊乱的程度和类型。单一抗生素对亚硝化作用的脉冲干扰在三周内可恢复，而抗生素混合物对亚硝化作用造成更显著的脉冲干扰，对硝化作用的潜在压力干扰超过五个月都无法恢复。生物信息学分析显示，典型的亚硝酸盐氧化(Nitrospira defluvii)和潜在的完全氨氧化(Ca. Nitrospira nitrificans)种群都存在显著的扰动，这与硝化作用的压力扰动密切相关。除了这种功能干扰外，抗生素混合物还减少了OTC的生物吸附并改变了其生物转化途径，与将OTC作为单一抗生素处理时产生的转化产物相比，产生了不同的转化产物。综上所述，这项研究阐明了抗生素混合物如何影响硝化微生物组功能紊乱的程度、类型和持续时间，并为抗生素残留物作为抗生素混合物(而非单一抗生素)存在时的环境后果(例如，它们的命运、转化和生态毒性)提供了新的见解。

图文摘要    

论文ID

原名：Effect of antibiotic cocktail exposure on functional disturbance of nitrifying microbiome

译名：抗生素混合物暴露对硝化微生物组功能紊乱的影响

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：13.6

发表时间：2023.5

通讯作者：Seungdae Oh

通讯作者单位：韩国庆熙大学

DOI号：10.1016/j.jhazmat.2023.131571  

实验设计

结果与讨论

1.两种抗生素混合物对硝化作用造成更深远的破坏

对生物反应器的铵去除效率(ARE)进行了五个月的监测。没有抗生素的N反应器在整个运行期间的ARE>99%。NO反应器在第7天的ARE为95%，之后在第21天恢复到接近其原始水平(>99%)。NOS反应器的ARE在第3.5天迅速下降至40%，2个月后缓慢恢复到与N反应器相当。这些结果表明，与单一抗生素相比，抗生素混合物的破坏作用更强、更持久。同样，虽然N和NO反应器都表现出几乎完全(>99%)的硝酸盐转化效率(NCE)，但NOS反应器在运行期结束时转化率仅为52%。这些结果表明，抗生素混合物对硝化作用的破坏可能比单一抗生素造成的破坏持续更长时间。

一些研究比较了单一化学品与化学品混合物对亚硝化的影响。例如，虽然发现罗红霉素和Cu(II)单独抑制亚硝化仅为10%，但将它们联合使用可将抑制效果提高至60%。同样，与单独使用CuO或OTC观察到的70-80%的亚硝化率相比，两者的混合物将这一比率降低至51%，而CuO-SMX混合物也抑制了50%的亚硝化，尽管这两种化学物质对亚硝化作用没有直接的抑制作用。在本研究中观察到的抗生素混合物对硝化作用的破坏程度与之前的报道一致(图1)。此外，这项研究还表明，这种破坏的程度可能是高度动态的，因为在五个月的操作过程中，最初的抑制作用随后逐渐恢复。它还揭示了破坏的程度可能因分解代谢步骤而异。

进行生物信息学分析以提供有关实验中观察到的高度动态、分解代谢步骤依赖性(亚硝化与硝化)和组分依赖性(单一与混合物)破坏的线索(图1A-B)。图S1说明了稳定状态下三个反应器中微生物组的主要类别。α变形菌门是最丰富的(平均28%)，其次是γ变形菌门(20%)、拟杆菌门(19%)、绿弯菌门(3%)、Anaerolineae(3%)和Nitrospiria(0.7%)。图1C比较了三个反应器中三种主要硝化属(Nitrosospira、Nitrosomonas和Nitrospira)的相对丰度。在N和NO反应器之间，这三个属的丰度没有显著差异。相比之下，Nitrosomonas(AOB)和Nitrospira(NOB)在NOS反应器中的丰度均显著降低(与N相比分别降低6倍和8倍)，而另一种AOB，Nitrosospira在NOS反应器中的丰度增加了4倍。

图2显示了主要硝化种群的系统发育关系。Nitrosomonas包括与N. oligotropha、N. uraea、N. nitrosa和N. europaea相关的操作分类单元(OTUs)。与N反应器相比，NO和NOS反应器中N. nitrosa(OTU0006和OTU0012)和N. europaea(OTU0007、OTU0011、OTU0010和OTU0005)的丰度明显降低。N反应器中的Nitrospira以N. defluvii(OTU0001、OTU0002和OTU0003)和Ca. N. nitrificans(OTU0009)为主。尽管OTU00001和OTU0002在NOS反应器中没有太大差异，但N. defluvii OTU0003和Ca. N. nitrificans OTU0009明显受到抑制，这与在实验中观察到的对硝化作用的显著扰动一致(图1B)。因此，生物信息学结果确定了可能导致亚硝化和硝化之间破坏程度的差异以及单一和混合抗生素的不同影响的物种。

使用QIIME2在分类学上鉴定的主要属包括Nitrosomonas、Nitrosospira和Nitrospira，它们经常出现在天然和工程硝化微生物组中。特别是，揭示了具有可区分的氮分解代谢形式的两个Nitrospira群的存在，即comammox(Ca. N. nitrificans)和典型NOB(N. defluvii)。与单一抗生素相比，Ca. N. nitrificans对化学混合物(阿奇霉素和2[5H]-呋喃酮)更敏感，这与本研究中观察到的Ca. N. nitrificans对抗生素混合物的敏感性一致(图2)。Ca. N. nitrificans和N. defluvii都能够排泄细胞外聚合物质(EPS)，这些物质可以作为抵御有毒化学物质的外部屏障。尽管已知N. defluvii比Ca. N. nitrificans产生更多的EPS并形成生物膜，但Ca. N. nitrificans和N. defluvii都能够分泌EPS，EPS可以作为对抗有毒化学物质的外部屏障。因此，在NOS反应器中观察到的N. defluvii与Ca. N. nitrificans相比存活率的提高可能归因于有毒化学物质的吸收降低。

一个有趣的问题是，尽管观察到反应器之间的AOB群落存在差异，但NO和NOS反应器如何能够在稳定状态下保持较高的ARE。与N反应器相比，NO反应器中N. nitrosa(OTU0006和OTU0012)的丰度较低，同时出现了两个N. europaea相关的OTUs(OTU0007和OTU0011)。然而，N. europaea在NOS反应器中受到严重抑制，而Nitrosospira则得到富集。此外，单一或混合抗生素对N. oligotropha的丰度影响不大，而混合抗生素对Nitrosospira和N. nitrosa的丰度影响较大，OTC和SMX对其抑制作用较强。因此，尽管AOB群落响应抗生素处理而发生变化，但反应器的稳定亚硝化性能可能是由于缓冲作用。如图1所示，由于硝化生物反应器中存在不同的AOB，即使一部分群落受到抗生素的严重抑制，那些更具抗性的AOB物种也可以保持整体性能水平。因此，本研究中观察到的缓冲效应强调了维持高水平生物多样性和功能冗余的重要性，以确保污水处理厂内稳定的氮去除。

图1. NO和NOS反应器的硝化性能和微生物组。测定三个生物反应器的(A) ARE和(B) NCE。(C) 3个硝化属的log2转化相对丰度比。误差条表示平均值的标准偏差。      

图2. 硝化种群的系统发育关系。系统发育树中显示了主要的OTU(丰度>0.1%)和与硝化作用相关的参考菌株。包含的参考文献(括号中的登录号)适用于那些具有已知氮代谢能力的物种(红色为典型AOB，蓝色为典型NOB，绿色为comammmox)。气泡的大小表示每个OTU的相对丰度。

2.两种抗生素混合物改变了抗生素残留的去除途径

NO和NOS反应器在第7天表现出相似的OTC去除效率(73–75%)，并在运行的五个月内逐渐增加(图3)。尽管NOS反应器的增加速度较慢，但两个反应器最终在第130-151天达到了93-96%的去除率。NOS反应器中的SMX去除率在第7天仅为25%，但在第130-151天增加到>99%。就OTC和/或SMX的去除效率而言，两个硝化反应器均在第109-151天达到准稳态。据报道，在微生物燃料电池和硝化和反硝化系统中，OTC和SMX作为单一化合物的去除率为70-99%，而生物除磷系统对OTC和SMX混合物的去除率仅为6-23%。本研究中的硝化生物反应器实现了比以前报道的生物过程更高的OTC和/或SMX去除效率。

微污染物在环境中经历各种分解途径，包括生物转化/生物降解、生物吸附和非生物过程(例如，挥发和光水解)。为了确定三个生物反应器中去除抗生素的主要途径，在六种实验条件下进行了批次测定(图3C)。在非生物-NO和非生物-NOS条件下，约有一半(48–49%)的OTC被去除，但在活性-NO和活性-NOS条件下去除率高达88-90%。在两种非活性条件下OTC的去除在NO和NOS之间存在显著差异(P<0.05)。非生物-NOS和非活性-NOS条件下的OTC去除率没有显著差异，这表明生物吸附对整体OTC去除率没有显著贡献，这主要归因于NOS反应器中的非生物途径和生物转化。相比之下，与非生物-NO条件相比，非活性-NO条件表现出更高的OTC去除率(70%)，表明除了非生物和生物转化途径外，生物吸附介导的OTC去除还发生在NO反应器中。

还在三个实验设置下分析了SMX的去除途径(图3D)。在非生物-NOS条件下SMX减少了11%，在非活性-NOS条件下上升到22%。然而，活性-NOS条件下SMX去除率显著上升至>95%。这些结果表明，SMX的去除主要是通过生物转化发生的，其他途径的贡献较小。这些批次测定结果与生物反应器的观察结果高度一致，从而量化了OTC和SMX的主要去除途径。

生物吸附是污水处理厂去除各种微污染物的重要途径。有趣的是，在SMX存在的情况下，OTC的生物吸附潜力明显降低。微生物表面和EPS通过生物吸附参与与微污染物的物理化学相互作用。细胞表面通常具有多种可促进生物吸附的结合位点(例如，羧基、胺基、羟基和疏水区)。由于SMX和OTC共享一些相同的官能团(例如，胺和甲基)，细胞表面和OTC之间的生物吸附相互作用可能受到来自SMX的竞争性干扰，当OTC作为抗生素混合物的一部分时会降低OTC的生物吸附。

图3. OTC和SMX的去除效率和途径。在反应器运行期间测定(A) OTC和(B) SMX的去除效率。(C) OTC和(D) SMX的去除途径在与反应器分开的稳定状态下在浴烧瓶中进行评估。星号表示统计显著性(p<0.05)。

3.两种抗生素混合物诱导不同的OTC降解途径

在存在和不存在SMX的情况下，OTC生物转化的变化促使我们进一步研究生物转化途径。采用LC-MS对一个进料循环中NO和NOS反应器的混合液样品进行分析，确定了稳态下OTC和SMX的TPs。观察到的八个TPs(表S1)与之前研究中确定的完全不同。因此，本研究基于实验观察到的TPs(图4)提出了六种OTC生物转化途径，这些途径不同于之前提出的与C21H19NO7和C18H25NO4相关的途径。提出用于NO反应器的三种初始TPs是(1)衍生自去甲基化、脱羰基和羟基化的TP406，(2)衍生自去甲基化和脱水的TP379，以及(3)衍生自去甲基化、脱水和脱羰基的TP312。然后，TP333可在羟胺转化和脱水后从TP406和/或在脱羰基和脱氨基后从TP379衍生而来。为NOS反应器提出的两个初始TP是(1) 衍生自脱甲基和脱氨基的TP403和(2)衍生自去甲基的TP447。虽然没有检测到与第一个途径相关的更多TPs，但TP447在羟基化、羟胺转化、脱水、脱羰基和去甲基化后转化为TP296。由于在NO和NOS反应器中都观察到了TP429，因此无论是否存在SMX，导致TP429的生物转化途径都可能发生。相比之下，检测到的其他TPs在OTC单独和OTC/SMX混合物中完全不同。这些结果表明，SMX的存在改变了OTC的转化途径。

本文还研究了NOS反应器中SMX产生的潜在TPs(图5和表S2)。LC-MS图谱显示SMX的m/zv为254，保留时间为15.6分钟。SMX在80 h的强度面积的相对比率<0.05，这也与使用HPLC确定的去除效率(>95%)高度一致(图3)。在硝化条件下发现的SMX的TPs在之前的一些研究中已有报道，包括TP238、TP283和TP123，其中TP123被提出通过TP81转化为TP92。TP238的转化与芳香环上胺基的脱氨作用有关。TP283是SMX与硝化过程中形成的游离亚硝酸发生取代反应，用亚硝酸盐离子取代SMX中芳香环的胺基。当胺化作用下的S-N键断裂将SMX转化为TP123时，羟基化进一步将TP123转化为TP81，最终经历开环反应形成TP92。本研究确定了两种新的生物转化途径。第一条途径涉及TP189，其进一步转化为TP157，而第二条途径通过脱水产生TP86，经羟基化和羟胺转化后TP102进一步分解为TP71。本研究为硝化微生物组鉴定出新的SMX生物转化途径，从而大大扩展了SMX TP库。本研究未评估SMX作为单一抗生素的生物转化途径。本研究中SMX的途径与以前的研究不同，至少部分是由于OTC的存在，这有待未来的实验验证。

迄今为止，关于抗生素混合物对抗生素成分生物转化影响的报道很少。在SMX、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的混合物中，其他五种磺胺类药物的分解速度比SMX慢两个数量级。先前的研究表明，其他五种磺胺类药物充当过氧化物酶和SMX之间的电子载体，从而加速SMX的分解。此外，据报道，与单一抗生素相比，在SMX存在的情况下，OTC的去除率增加了两倍。作者提出，由于混合物中存在应激源，会排出更高水平的EPS，从而增加通过EPS介导的生物吸附去除。

除了先前报道的吸附和催化反应的影响外，本研究的生物信息学结果还强调了硝化和异养微生物组在抗生素残留去除途径中的潜在作用。氨单加氧酶(AMO)和羟胺脱氢酶(HAO)是催化铵生成亚硝酸盐的两种关键酶。由于这些酶具有广谱、非特异性靶点，它们也能够氧化微污染物。AMO可能参与OTC第一途径的羟基化(即C4处的NH2转化为-NH(OH))，结合脱羰基(C2处的-CO(NH2))和去甲基化(C4处的-NH(CH2)2)，可能导致TP406。TP406可在HAO(-NH(OH)到NO)的帮助下脱水进一步转化为TP333。第六条途径涉及OTC的去甲基化以产生TP447。将TP447转化为TP296可能涉及AMO的羟基化和HAO的羟胺转化，以及其他酶促反应，例如C2的脱羰、脱水和C4的去甲基化。这些结果表明，硝化微生物组显著促进了NO和NOS反应器中的OTC生物转化。

Hyphomicrobium、Methylobacterium-Methylorubrum和Sphingopyxis在NO反应器中显著富集，因此可能与OTC去除有关。Hyphomicrobium和Methylobacterium-Methylorubrum是甲基营养菌，可使用胺脱氢酶降解各种胺基(例如，三胺、二胺和甲胺)，这可能涉及到去除OTC的第三和第四途径的脱氨作用(图4)。Sphingopyxis通过芳香双加氧酶促进OTC等芳香族化合物的环裂解，可能导致本研究中第一和第二途径中TP333和TP312的降解。Methylotenera和Ochrobactrum在NOS反应器中的比例过高，而在NO反应器中占优势的3个分类群的相对丰度较低。由于其生物膜形成能力，Methylotenera在含有多种化学物质的高胁迫环境中存活，并且凭借其胺代谢能力，可能参与与OTC去除的第五条途径相关的脱氨作用。相反，Ochrobacterium驱动与CH3、CO和C=O键相关的催化分馏反应，可能促进了转化途径中涉及的去甲基化和脱水反应(图4)。总体而言，在NO和NOS反应器中观察到的OTC的不同生物转化途径可归因于不同的异养和硝化物种的富集，这些物种具有不同的OTC代谢/酶促能力。

SMX的初始生物转化涉及异恶唑环的裂解，促进了键的裂解，分别通过AMO羟基化和脱水将其分裂为TP189和TP86。这两种TPs的进一步转化可能涉及AMO的羟胺转化(TP189到TP157)和羟基化(TP86到TP102)，然后是HAO的羟胺转化(TP102到TP71)。Methylotenera和Ochrobactrum在NOS反应器中占主导地位，表明它们可能参与SMX和OTC的降解。Ochrobacterium介导异恶唑环的裂解，而Methylophilaceae的成员(Methylotenera)已知可通过C-N、S-N和N-N键的裂解或分裂来降解磺胺嘧啶。因此，Ochrobacterium和Methylotenera可能参与了SMX异恶唑环的裂解。在本研究(图S2)和过去的研究中观察到，在存在SMX的情况下，Methylotenera和Ochrobactrum显著富集，突出了它们在代谢SMX中的潜在作用。

图4. 提出的OTC转化途径。根据转化产物的化学式(含m/z值)提出的六种途径(表S1)由带有数字的蓝色箭头表示，并与先前报告的一种途径(黑框)进行比较。根据对NO(绿色框)、NOS(红色)或NO和NOS反应器(黄色)的观察，对这六种途径进行了区分。每个转化产物下方的热图表示在NO和NOS反应器中随时间观察到的OTC或其衍生物(相对于最高强度)的出现。    

图5. 提出的SMX转化途径。表S2中确定的转化产物提出的两条途径用绿色箭头显示，并与之前报告的三种途径(黑框)进行比较。每个转化产物下方的热图表示在NOS反应器的进料循环中随时间观察到的SMX或其衍生物(相对于最高强度)的出现。

4.抗生素混合物可能具有更显著的毒理学后果

母体抗生素及其TP(图4、图5)的存在促使我们研究硝化生物反应器是否可以降低总体毒性。为此，对稳态NO和NOS系统的出水进行了抗菌活性测试，并与对照(无抗生素)、SMX、OTC(作为NO反应器的进水)以及OTC和SMX(作为NOS反应器的进水)进行了比较。将六种条件下的异养生长数据拟合到改进的Gompertz模型中，模型参数拟合良好(R2>0.9)。图6呈现了六种条件下的24小时异养生长和滞后期。SMX、OTC和SMX/OTC对细胞生长的抑制作用分别为5%、20%和60%。特别是，两种抗生素混合物严重延迟了指数增长(即延长了滞后期)，而其他条件下的滞后期持续时间没有显著差异。实验结果表明，单一抗生素和两种抗生素混合物之间的毒性程度存在显著差异。 

两种应激源的联合效应可以被描述为可忽略(即联合效应与其自身最强的效应相同)、累加(等于单个化学物质的总和)、拮抗(低于两者的总和)，或协同(高于总和)。作用于不同靶点的单个化学物质经常观察到协同毒理学后果。例如罗红霉素和Cu(II)的混合物，它们分别破坏细胞膜合成和Cu依赖性细胞酶活性。OTC和SMX是具有不同作用方式的抑菌抗生素。OTC通过干扰mRNA与其核糖体结合位点(30S亚基)之间的相互作用来抑制蛋白质的翻译过程。相反，SMX通过破坏蛋白质结构单元(特别是二氢叶酸)来抑制蛋白质合成。由于这些不同的作用方式，两者的共同作用有可能是协同的，这与本研究的实验观察结果一致(图6)。

NO和NOS流出物中微生物的细胞生长和滞后期与对照组相当，表明这些流出物至少对接种群落的异养活性没有可观察到的毒性。本研究中使用的简单群落药敏试验方法常用于毒性测定，结果可重复性好。然而，结果在很大程度上受到微生物群落中快速生长和优势物种的特定功能响应的影响。此外，尽管反应器流出物包括各种TPs，这些TPs的毒性可能与它们的母体化合物在摩尔基础上相当，但抗菌测试可能低估了TPs的毒性，因为TPs的浓度可能低于母体化合物。因此，除了对反应器流出物中的抗生素残留物进行整体毒性测试外，还使用基于QSAR分子结构的毒性预测方法估算了单个抗生素残留物的毒性(表S1和S2)。毒性是根据黑头呆鱼的96小时LC50计算的(即96 h后导致50%种群死亡的浓度)。而OTC的LC50为2.44 µM，NO反应器中OTC衍生物TP406为0.15 µM，TP379为0.24 µM，TP333为13.3 µM，TP312为0.39 µM。在NOS反应器中观察到的OTC衍生物TP447、TP403和TP296的LC50分别为1.01 µM、0.95 µM和0.21 µM，而在NO和NOS反应器中均发现TP429，LC50为0.89 µM。QSAR方法表明，OTC TPs的潜在毒性在单一抗生素系统和多重抗生素系统之间存在显著差异。SMX的LC50为11.1 µM，而SMX TPs的值超过200，表明潜在毒性降低。这些结果表明，虽然一些TPs的毒性可能低于其母体化合物，但许多TPs，尤其是那些来自OTC的TPs，可能具有更高的毒性。

抗生素通过各种转化途径降解，产生各种已知和未知的残留物。OTC在典型环境条件下会自然降解，可能导致形成具有显著毒性的TPs。尽管生物转化通常被认为比物理化学转化产生毒性更小的TPs，本研究表明，OTC可能并非如此。在评估特定化合物的毒性时，另一个重要的考虑因素是它在目标环境中的含量。尽管在环境中存在大量的场外交易数据，但有关场外交易衍生品的相应信息在很大程度上仍然未知。据估计，释放到水生环境中的OTC约有一半处于转化状态(例如，4-epi-OTC、α-apo-OTC和β-apo-OTC)，而SMX估计有30-80%以TPs的形式存在。本研究确定了比OTC本身具有更大潜在毒性的新OTC残留物，因此未来的研究需要监测这些残留物的分布和水平以及它们与其他环境相关水平的水污染物的联合效应。这将有助于准确确定抗生素及其残留物的生态后果。

图6. 抗生素残留的抗菌药敏试验。五种实验条件下(A)细胞的相对生长和(B)相对滞后期。将每个实验条件下的细胞生长和滞后期标准化到对照组(无抗生素)。星号表示统计显著性(p<0.05)。

5.结论、实际意义和未来研究

本研究扩展了目前对多种抗生素混合物与单个抗生素对硝化系统影响的理解。本文的研究结果为以下方面提供了新的见解：i)多种混合物的深远毒性，ii)混合物破坏的不同程度对各自的硝化分解代谢步骤(特别是硝化作用的破坏)及其相关物种种群(Nitrospira)造成了不成比例的影响，以及iii)生物转化途径的改变和潜在的毒性。因此，这些见解对脱氮生物工艺的可持续设计和运行具有重要的实际意义。

首先，本研究结果表明，抗生素混合物对硝化过程具有高度动态的破坏作用，这与单一抗生素的作用不同。尽管单独OTC和OTC与SMX混合对第一个硝化步骤(亚硝化)的破坏是脉冲状的(即暂时冲击后恢复)，但混合物在第二个硝化步骤(硝化)中的影响持续了数月。以前的大部分研究都致力于检查单个化学物质对单个模型分离株的急性毒性。尽管这方面的研究很重要，但对真实环境的相关性和影响可能有限。本研究成功地记录了抗生素应激源在很长一段时间内对复杂硝化微生物组的急性和慢性影响。因此，该结果与全规模硝化系统的原位响应具有更直接的相关性。

其次，本研究还确定了OTC单独或SMX存在时对亚硝化作用的破坏形式的差异。特别是，对亚硝化作用的脉冲破坏在NO和NOS反应器中恢复，而OTC/SMX混合物对硝化作用的破坏在反应器运行的5个月期间没有完全恢复。生物信息学分析确定了N. defluvii和Ca. Nitrospira nitrificans与这种对硝化过程的持续破坏有关。这些物种对化学应激源的高度敏感性具有实际意义，因为它可以帮助污水处理厂操作员根据存在的有毒应激源更好地诊断/管理脱氮过程。例如，由于特定物种的敏感性，他们可以更密切地监测它们，以便主动识别不良事件，例如性能不佳和系统故障。尽管我们提供了受单一抗生素和多种抗生素系统影响的关键硝化种群的机制描述，但建议基于组学的研究(例如，宏基因组学和宏转录组学)和/或利用功能基因/酶靶点的互补分子实验技术(例如，amoA)可用于确定导致本研究中观察到的功能破坏的单一和多种抗生素混合物的确切作用模式。

最后，OTC/SMX组合还改变了OTC的生物转化途径和由此产生的生态毒性。先前的研究表明，抗生素可以根据环境条件遵循不同的转化途径，但很少有人关注其他抗生素残留物存在的影响。本研究确定了混合抗生素系统中新TPs的形成，即来自OTC的TP403和来自SMX的TP157。这两种TPs在80 h内抵抗了进一步的转化，TP403具有与其亲本形式相当的生态毒性。基于这些结果，建议在未来的研究中更密切地监测TPs的命运和生态毒性。这一点尤其重要，因为尽管许多TPs被认为比其母体化合物的毒性更低，但本研究中观察到的一些TPs可能具有更持久的毒性。本研究结果还强调了原始形式和转化形式的抗生素残留以及与其他抗生素结合可能与自然环境更相关的潜在生态后果。我们的工作并未尝试确定TPs的确切浓度或其特定的分子作用机制。因此，这些工作将在未来的环境毒理学和生物过程工程方面的研究中得到极大的关注。

抗生素在几乎所有环境中都以混合物而不是单一化合物的形式存在。硝化作用在自然和工程生物系统中都是一项重要的生态系统功能，它对环境胁迫特别敏感。本研究表明，与单一抗生素相比，多种抗生素对硝化微生物组的毒性更大(协同)。此外，实验和计算结果都表明，其他抗生素残留物的存在显著改变了抗生素污染物硝化和转化途径的破坏类型/程度。研究结果对处理含药物废物流的生物脱氮工艺的可持续设计和运行具有实际意义。

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