科研丨北京放射医学研究所: 口服魔芋葡甘露聚糖通过调节肠道菌群和增加短链脂肪酸预防电离辐射损伤(国人佳作)

编译：微科盟阿Z

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

电离辐射损伤通常发生在放射治疗中，可导致造血系统和胃肠道系统的损伤。放射防护药物主要应用于医院，但仅限于注射剂，其肠道保护作用有限。本文研究了口服魔芋葡甘露聚糖(KGM，天然大分子可溶性膳食纤维)对电离辐射损伤的防治作用。在6.5Gy γ-射线全身照射(WBI)或13Gy全腹照射(WAI)前，用KGM(0.4g/kg)喂养小鼠3天或注射临床药物氨磷汀。在WBI实验中，KGM改善了股骨和脾脏的血细胞恢复和骨髓细胞增殖，尽管其效果弱于或类似于氨磷汀。在WBI实验中，KGM的肠道保护作用与氨磷汀相似或略好于氨磷汀，涉及再生隐窝数量、绒毛长度和肠道通透性。此外，KGM显著提高了WBI和WAI小鼠的存活率，这与氨磷汀一致。KGM作为一种益生元，可提高肠道菌群丰度、益生菌数量和短链脂肪酸的产生，维持肠道内稳态。此外，KGM还能抑制辐照后人肠上皮细胞的凋亡。KGM是一种很有前景的抗电离辐射损伤的天然大分子。

论文ID

原名：Oral konjac glucomannan for prevention of ionizing radiation-induced injury by regulating gut microbiota and increasing short chain fatty acids

译名：口服魔芋葡甘露聚糖通过调节肠道菌群和增加短链脂肪酸预防电离辐射损伤

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：8.2

发表时间：2023.4

通讯作者：金义光，袁伯川

通讯作者单位：北京放射医学研究所

DOI号：10.1016/j.ijbiomac.2023.124402

实验设计

结果与讨论

1KGM特征

1%KGM水溶液的粘度为36.3Pa·s。KGM的分子量为1.096×105Da，多分散性(PDI，Mw/Mn)为1.65。KGM的单糖组成为甘露糖和葡萄糖，含量分别为509.97mg/g和317.18mg/g。KGM的甘露糖与葡萄糖的比值为1.608。KGM的乙酰取代度为0.00189。KGM的FTIR光谱在3341cm-1处显示出羟基(O-H)伸缩振动的特征宽峰(图S1)。C-H的伸缩振动在2877cm-1处显示出一个微弱的波段。C-H的弯曲振动在1364cm-1和1016cm-1处被确认。1713cm-1处的特征峰属于乙酰基。1621cm-1处的峰归因于C-O的伸缩振动。KGM的FTIR光谱与之前的研究一致。

2KGM改善WBI诱导的造血损伤

大剂量的电离辐射总是对造血系统造成高风险损害。快速增殖的骨髓细胞特别容易受到辐射损伤，从而阻碍了血细胞的更新。本研究从血细胞减少和成熟血细胞的生成能力方面全面评估了KGM对造血系统的辐射保护作用(图2A)。辐射后早期各组大鼠外周血成分RBC、WBC、PLT、HGB、Lym均明显下降，特别是在WBI模型组。WBI模型组和KGM组的RBC从第14天开始逐渐恢复，而氨磷汀从第7天开始促进恢复过程(图2B)。在某些特定的时间点，如第10天和第18天，KGM组的RBC明显高于WBI模型组。同时，氨磷汀组的RBC水平波动最小，在第14天明显高于KGM组。正如预期的那样，储存在RBC中的携氧蛋白HGB的变化趋势与RBC的变化趋势一致(图S2A)。此外，与WBI模型组相比，KGM和氨磷汀均显著提高了脉搏氧饱和度(SpO2)(图S2B)，这表明携氧能力增强。WBC在三组之间没有明显差异，都是在辐射后急剧下降后慢慢上升(图2C)。至于WBC的亚型Lym，口服KGM和腹腔注射氨磷汀均可明显促进第7天至第28天的恢复(图2D)。氨磷汀、KGM、WBI模型组的PLT分别在辐射后第7、10、14天开始升高(图2E)。此外，氨磷汀组在第7天和第10天的PLT水平高于KGM组，而在实验中期阶段，它们的PLT水平高于WBI模型组。综上所述，KGM在保持WBI后的外周血水平方面表现出良好的性能，尽管其性能弱于临床细胞保护剂氨磷汀。辐射不仅损害现有的成熟血细胞，而且对骨髓产生新血细胞的能力也有伤害。造血系统主要由骨髓、脾脏、胸腺和淋巴结组成，并参与细胞血液成分的产生。最初，我们通过H&E和Ki67染色研究了辐射引起的股骨和脾脏组织的损伤。辐射严重损害了股骨和脾脏中的细胞，使细胞数量减少(图2F和图S3A)；然而，KGM对股骨中的细胞提供了保护(图2F，G)。与WBI模型组相比，KGM和氨磷汀都增强了脾脏的白髓面积(图S3B)，表明KGM和氨磷汀具有较强的免疫原性功能和消除缺陷红细胞和血小板的能力。高Ki67比例意味着有大量的增殖细胞，用黄色染色区域表示。与WBI模型组相比，KGM组和氨磷汀组股骨和脾脏的黄色染色面积更大(图2H和图S3C)，说明KGM促进了股骨和脾脏的细胞增殖。BMNCs数量是辐射引起的造血损伤的一个关键指标。WBI在第7天明显减少了BMNCs的数量，表明血细胞的再生能力较弱(图2I)。相比之下，KGM和氨磷汀显著促进了大量BMNCs的血细胞再生。BMNC含有大量的造血干细胞，并且可以发育成各种类型的血细胞，包括粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞等。与BMNCs的特征一致，KGM和氨磷汀在培养7天后显著增加了CFU的数量，包括CFU-GEMM、CFU-GM和CFU-MK(图2J)。因此，KGM减轻了辐射对造血系统的损伤，促进了髓外造血功能的恢复，其效果与氨磷汀相当。KGM是一种有前景的WBI辐射保护剂，可替代氨磷汀，更方便、更安全。

受辐射动物的存活率直接反映了治疗的辐射防护效果。接受KGM或氨磷汀单次6.5Gy辐射治疗的小鼠中，80%存活，而WBI模型组的存活率仅为50%(图S4A)。照射后小鼠体重明显下降，至第4天逐渐恢复，其中KGM和氨磷汀组的恢复趋势优于WBI模型组(图S4B)。WBI模型组小鼠表现出明显的厌食和延迟反应，而KGM和氨磷汀组小鼠精神状态更为活跃。KGM或氨磷汀处理小鼠总体健康状况良好，存活率高，但KGM的WBI保护作用弱于氨磷汀。

图1. 口服KGM调节肠道菌群，增加短链脂肪酸并预防辐射诱导的造血和肠道损伤。

图2. WBI实验程序及小鼠造血功能评估。

(A)WBI及处理时间表。RBC(B)、WBC(C)、Lym(D)和PLT(E)的外周血计数(n=4)。股骨切片的H&E和Ki67染色图像(F)，以及骨髓细胞(G)和Ki67阳性细胞的比例(H)(n=3)。(I)第7天的BMNCs数量和(J)培养7天后CFU-GM、CFU-GEMM和CFU-MK的CFU(n=3)。数据以平均值±SD表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，氨磷汀和KGM组vs.WBI模型组。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，KGM组vs.氨磷汀组。

3KGM改善WAI诱导的肠道损伤

当全身或部分身体暴露于电离辐射时就会发生辐射损伤。肠道对电离辐射极其敏感，辐射后隐窝干细胞显著减少，绒毛缩短。作者深入研究了KGM对肠道的辐射保护作用(图3A)。照射1天后，小鼠上皮细胞密度显著降低(图3B)。在第3.5天，WAI模型组小鼠的肠隐窝消失，肠绒毛缩短，而KGM和氨磷汀处理小鼠的隐窝和绒毛结构得到了很好的保护(图3B)。受损的隐窝在干细胞增殖后再次出现，放射防护治疗可以加速这一过程。Ki67染色显示细胞增殖，反映受损肠的再生。在WAI模型组中观察到Ki67阳性染色区域较少，而KGM对Ki67表达的改善作用高于氨磷汀(图S5)。KGM组的再生隐窝明显多于WAI模型组(图3C)，但与氨磷汀组相比无显著差异。此外，KGM组的肠绒毛明显长于WAI模型组和氨磷汀组(图3D)。在第7天，WAI模型组的再生隐窝结构被扭曲，而KGM和氨磷汀促进了排列完整的绒毛的生长(图3B)。电离辐射对肠道的一个重要损伤是炎症和高肠道通透性，导致肠道功能障碍。由于FITC-葡聚糖的大分子性质，其被用于评估肠道通透性。DAO定位于肠粘膜上层绒毛膜上皮细胞的细胞质中。肠上皮细胞的损伤促进DAO进入血液循环，血清中的DAO是评价肠屏障损伤的理想指标。根据FITC-葡聚糖的数据，与WAI模型组相比，KGM和氨磷汀显著降低了肠道通透性(P<0.05，图3E)。WAI模型组血清DAO水平显著升高，而KGM组和氨磷汀组的DAO维持在接近健康个体的低水平(图3F)。因此，KGM对电离辐射的肠道保护作用很高，甚至比氨磷汀更好。KGM也对WAI提供了高度的全身保护。与WAI模型组相比，KGM组和氨磷汀组小鼠的体重在早期下降幅度较小，并且在后期增加较快(图3G)。严重的肠道损伤阻碍了营养的获取，导致体重减轻甚至死亡。与WAI模型组的低存活率(60%)相比，KGM和氨磷汀提高了辐照小鼠的存活率(高达86.7%)(图3H)。此外，KGM和氨磷汀有效地挽救了15Gy辐照小鼠，存活率为73.3%，而高剂量WAI小鼠全部死亡(图3I)。

使用OFT方法评估受辐射小鼠的运动能力，反映辐射损伤后的恢复延伸。与WAI模型组相比，KGM组和氨磷汀组的死亡时间明显缩短，平均速度和总距离增加(图S6)。因此，KGM和氨磷汀显著改善了辐照小鼠的身体恢复，接近健康小鼠的正常水平。综上所述，KGM对WAI损伤的肠道保护作用与氨磷汀相似或稍好。此外，根据中国营养学会和美国心脏协会的指南，成人每日膳食纤维的推荐摄入量为25-30g，尽管常规剂量实际上为15-20g。60kg体重的人服用25-30g的剂量，20g体重的小鼠服用5-6.15g/kg的动物等效剂量(AED)。由于在0.4g/kg的剂量下获得了满意的效果，因此我们没有探索>0.4g/kg的剂量的效果。

图3. WAI实验程序及小鼠肠道评估。

(A)WAI和处理时间表。(B)辐射后第1、3.5和7天肠切片的H&E染色图像。第3.5天的再生隐窝数量(C)和肠绒毛长度(D)(n=3)。血清中FITC-葡聚糖的相对水平(E)，血清中的DAO水平(F)，和体重曲线取决于13 Gy辐射后的时间(G)(n=4)。存活率取决于13Gy辐射后的时间(H)和15Gy辐射后的时间(I)。数据以平均值±SD表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4KGM维持肠道菌群的多样性并增加了SCFAs

上述研究表明，KGM对辐射引起的损伤，特别是肠道损伤具有较高的保护作用。此外，KGM的肠道保护作用甚至优于氨磷汀。肠道菌群具有多种生理功能，并且在宿主的健康和肠道稳态中起关键作用。肠道菌群可能受到电离辐射的干扰。KGM作为一种有效的益生元可以被肠道菌群降解为SCFAs，促进肠上皮细胞的增殖和肠粘膜的生长。本研究发现，KGM对辐照后小鼠肠道菌群的保护效果较好，其操作分类单元(OTU)分别为250和293，甚至接近健康小鼠的情况。相比之下，WAI模型组和氨磷汀组的OTU分别显著降低至221和227(图4A)。本研究进一步发现，KGM组和健康组在肠道微生物群落丰富度和α多样性方面没有显著差异(图S7)。采用线性判别分析(LDA)效应量对不同组中丰富的类群进行分析。与其他辐照组相比，KGM显著增加了辐照小鼠中双歧杆菌(Bifidobacteriales)、放线菌(Actinobacteria)、丹毒丝菌(Erysipelotrichales)和布劳特氏菌(Blautia)的相对丰度。此外，氨磷汀增加了Eubacterium、Christensenellales和Family_XIII_AD3011_group的相对丰度(图4B)。事实上，不同组的细菌群落组成在辐照后发生了不同科属水平的变化(图4C和D)。因此，KGM增加了辐照小鼠肠道菌群的多样性，恢复了肠道菌群的功能，有利于肠道功能的恢复。与健康组相比，KGM增加了一些益生菌的相对丰度，包括乳杆菌(Lactobacillus)、Lachnoclostridium、Alloprevotella和布劳特氏菌(Blautia)(图4C)。众所周知，这些益生菌在肠道中产生SCFAs。与模型组相比，氨磷汀明显改善了f_Lachnospiraceae和阿克曼氏菌(Akkermansia)(P<0.05或P<0.01)。此外，KGM组f_Lachnospiraceae和阿克曼氏菌的相对丰度分别是WAI模型组的5.1和18.6倍(图S8)。众所周知，毛螺菌科(Lachnospiraceae)和阿克曼氏菌能促进SCFAs的产生。SCFAs在肠道能量供给、肠道粘膜屏障的维护、肠道运动的调节和免疫调节方面发挥着重要作用。WAI小鼠的粪便中SCFAs含量增加，其中KGM组的SCFAs含量最高。KGM组的乙酸(Ace)、丙酸(Pro)、丁酸(But)和总SCFAs分别是WAI模型组的2.9、1.8、3.2和1.4倍。同时，氨磷汀也通过保护益生菌改善了Ace和总SCFAs(图5A、B)。健康组、WAI模型组、氨磷汀组和KGM组的粪便平均pH值分别为7.20、7.18、7.16和6.80。KGM组的粪便pH值明显低于其他组，与健康组相比有统计学差异(P<0.05)(图5C)。

SCFAs通过调节免疫细胞产生的细胞因子来提高抗炎功能。IL-22作为一种重要的细胞因子，在调节炎症、诱导细胞增殖或抗凋亡信号、防止组织破坏和协助组织修复方面发挥着关键作用。IL-10控制肠道中微生物和食物抗原的慢性刺激，维持免疫平衡，因此被认为是最重要的抗炎细胞因子之一。与WAI模型组相比，KGM明显增强了小鼠肠道内IL-10和IL-22的含量(P<0.05或P<0.01)，表明KGM可有效激活肠道免疫屏障功能以保护肠道(图5D、E)。因此，KGM对肠道菌群的益处主要来自增加的SCFA，这些SCFA有助于肠道辐射保护。

图4. 各组肠道菌群的16SrDNA测序分析。维恩图(A)和已鉴定细菌菌株的进化分枝图(B)。每个点的颜色深度与其效果成正比。(C)群落直方图显示在科水平上的微生物组成谱。(D)热图显示属水平上微生物组成的相对丰度(n=3)。

图5. WAI小鼠的生理因素。各组小鼠粪便中的总SCFAs(包括乙酸、丙酸和丁酸)(A)和单一SCFA(B)的含量。(C)第7天WAI小鼠的粪便pH值。肠组织中IL-10(D)、IL-22(E)的含量。数据以平均值±SD表示。*P< 0.05，**P<0.01，***P<0.001。

5KGM和SCFAs对HIEC-6细胞的辐射保护作用

KGM即使在1000μg/mL的高浓度下对HIEC-6细胞也没有细胞毒性，表明其对正常细胞有很高的安全性。更重要的是，与模型组相比，KGM对HIEC-6细胞的电离辐射损伤具有较高的保护作用(图6A)。包括丙酸、丁酸和戊酸在内的SCFAs可以减轻HIEC-6细胞的辐射损伤，其中丁酸的保护作用最强，乙酸的保护作用较弱。流式细胞仪检测结果显示，KGM和丁酸的辐射保护作用很强，其细胞凋亡率分别为20.11%和15.09%，而模型组的细胞凋亡率很高(49.32%)(图6B和C)。其他SCFAs也能抑制辐射诱导的细胞凋亡。活/死染色也显示，KGM和丁酸盐显著提高了受辐射细胞的活力(图6D)。因此，KGM和SCFAs可以直接保护细胞免受电离辐射引起的损伤，巩固了KGM的体内保护机制。

图6. KGM和SCFAs对HIEC-6细胞的辐射保护作用。

(A)KGM和SCFAs孵育后HIEC-6细胞的细胞活力(n＝4)。(B)辐射后细胞凋亡的总体情况。(C)FITC/PI染色后HIEC-6细胞的流式细胞术图，其中插入的柱状图表示凋亡细胞群(n=3)。(D)KGM和SCFAs孵育后HIEC-6细胞的活/死染色。数据以平均值±SD表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

结论

随着核能(特别是放射治疗)的广泛应用，放射性损伤的风险日益普遍。遗憾的是，目前还没有有效、安全的方法来避免辐射对人体的危害。在本研究中，可溶性膳食纤维KGM被证明不仅保护造血系统免受辐射损伤，而且可以通过调节肠道菌群来改善辐射肠道损伤。此外，益生菌产生的SCFAs的上调还通过刺激细胞因子(包括IL-10和IL-22)的释放来建立肠道免疫微环境以促进肠屏障恢复。最重要的是，KGM作为一种易获得的可溶性膳食纤维，具有安全性高、使用方便等优点，可作为氨磷汀的替代品。KGM在保护电离辐射引起的损伤方面具有很高的转化潜力。

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