学术先声丨自研平台！病理AI结合多组学分析识别结肠癌免疫微环境分型

结直肠癌（CRC）是全球第三大致命性恶性肿瘤，高达50%CRC患者最终会发生转移，导致预后不良。随着测序技术和生物信息学的发展，基于多组学的分子分型逐渐成为CRC研究热点，但多组学数据复杂且高维度的特征导致从中提取有价值的信息来指导临床治疗仍然是一个巨大挑战。目前，传统的病理学评估依然是CRC诊断和治疗的重要依据。与此同时，人工智能在病理诊断及医学影像识别领域应用也得到了各界的广泛关注。通过病理AI图像识别技术和生信多组学数据分析，能够更有效且精准地评估CRC肿瘤微环境特征，在提高CRC诊断效率和提供预后指导方面具有巨大的潜在价值。 

近日，南方医院病理科与先声诊断科研团队合作，在eLife期刊（IF=8.713）发表了一篇结直肠癌免疫分子分型相关研究[1]。该研究使用先声诊断自主研发的人工智能数字病理图像分析平台（SimPathAI）进行了肿瘤病理图像组织分类、定量和空间分析，结合多组学数据对CRC的肿瘤免疫微环境（TME）进行了全面的亚型鉴定，并将CRC患者分为四种具有不同TME特征的分子亚型（CCCRC）。研究结果为CRC的TME分型和个体化治疗提供了依据，有助于提高CRC临床管理，并且研究的分型结果可作为指导今后临床试验设计的参考。

Research Highlights

1 结合病理AI图像识别和生信多组学分析构建CRC肿瘤免疫微环境分型。

2 新的CRC分子分型通过病理AI图像识别体现了组织学差异。

3 研究提供的分子分型结果可作为指导未来临床试验设计的参考。 

SimPathAI 病理AI分析平台

先声诊断自研的基于深度学习的SimPathAI病理AI分析平台，可以提供基于H&E染色病理图像的多组织类型（8种）的区域分割识别、单细胞水平的多细胞类型分割识别和量化、免疫分型识别、免疫细胞和基质细胞量化占比和空间分布分析等功能，该自动化病理AI分析流程将能大大提高临床病理科研的效率和准确性。

SimPathAI病理AI分析平台同时提供了端到端的分析流程包括病理图像标注云平台模块，图像预处理和质控模块，深度学习模型训练模块和可视化展示模块。该平台可为药物靶点发现和标志物探索、肿瘤免疫微环境量化、免疫分型研究提供多方位的数字病理标志物探索支持。

研究结果

1. 构建CCCRC免疫亚型  

通过文献调研，研究者收集和整理了61个TME相关signature，其中涵盖肿瘤细胞功能状态（ex：血管生成、缺氧、内皮-间充质转化等）、免疫细胞浸润以及肿瘤基质评估等生信算法，建立了全面的生物学框架来解析CRC患者肿瘤组织的TME特征。一致性聚类分析结果揭示了CRC的TME异质性，根据经验累积分布函数（CDF）和delta区域图，作者确定了最佳聚类的4种TME亚型（CCCRC）。为了进一步评估CCCRC亚型的鲁棒性，研究利用PAM算法构建了PAMR分类器，预测结果的整体误差率为15%，然后使用PAMR分类器对CRC-RNAseq队列进行CCCRC亚型预测，结果发现相同的四种CCCRC亚型，并且TME相关signature具有相似的组成成分。

C1（占所有肿瘤的35%，增殖亚型），以肿瘤增殖活性、肿瘤纯度较高及淋巴细胞和基质浸润较低或完全缺乏为特征，与冷肿瘤表型非常相似（图1B-E）。MYC、细胞周期、TP53和PI3K通路与增殖亚型相关，在C1亚型中的GSVA评分最高。

C2（占所有肿瘤的21%，免疫抑制亚型），免疫和基质成分相对较高，例如T细胞、M2巨噬细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs）（图1B-E）。然而，效应T细胞的浸润程度以及溶解分数都比C4亚型低得多。

C3（占所有肿瘤的24%，免疫排斥亚型），以基质成分的明显上调为特征，例如CAFs和癌干细胞，以及血管生成和缺氧标志（图1B-E）。

C4（占据所有肿瘤的20%, 免疫调节亚型），抗肿瘤免疫相关signature显著上调（如效应性T细胞、NK细胞和Th1细胞）。C4亚型的溶解分数也比其他亚型高，并且缺乏基质成分和其他免疫抑制成分，这表明它处于一个免疫调节的微环境中（图1B-E）。

图1. CCCRC分型特征

2. CCCRC亚型的病理学差异

为了进一步探究CCCRC亚型之间的生物学差异，研究者通过TCGA-CRC数据集的全切片图像（WSIs）来研究组织病理学表型，并将CCCRC分型与经典肿瘤免疫三分型-“沙漠”、“排斥”和“炎性”进行了比较。两名病理学家根据淋巴细胞丰度和空间位置与恶性上皮细胞进行显微镜下的组织病理学特征评估。使用深度学习算法通过HE染色病理图像来构建CRC多分类模型，并评估不同CCCRC分型之间的肿瘤、淋巴细胞和基质的丰度和空间分布。

CRC多分类模型由肌肉/非肌肉二分类器和七种组织类型组成，可以分类八种CRC组织类型：脂肪（ADI）、碎片（DEB）、淋巴细胞（LYM）、黏液（MUC）、平滑肌（MUS）、正常结肠粘膜（NORM）、肿瘤基质相关（STR）和结肠腺癌上皮（TUM）。肌肉/非肌肉模型在内部测试集的14,681个图像上表现良好，AUC约为0.99，准确率为0.99。与此同时，七类组织分类器也表现良好，不同组织类型的AUC均在0.99以上，在内部测试集的5741个图像块上准确率为0.95。当在外部测试集的4288个图像块上进行评估时，肌肉/非肌肉模型的AUC为0.95，准确率为0.91。在肌肉/非肌肉模型识别出的3633个非肌肉图像块中，七类组织分类器的不同组织类型的AUC在0.97到1之间，准确率为0.91。组织热图显示了模型在TCGA-CRC WSI中的预测结果（图2B）。在核心肿瘤（CT）区域，C4亚型肿瘤周围有较多的淋巴细胞浸润和较少的基质成分；C1亚型肿瘤数量显著增加；C2亚型淋巴细胞和基质浸润均高；C3亚型基质丰度最高，但淋巴细胞浸润最少（图2C-E）。本文还观察到C4亚型在淋巴细胞浸润至肿瘤含量比和淋巴细胞浸润至基质含量比方面均最高，其次是C2亚型和C3亚型最低（图2F，G）。   WSI的AI-支持空间分析验证了病理学家的半定量结果，C1亚型属于“冷”表型，C2亚型属于“免疫抑制”表型，C3亚型属于“排斥”表型，C4亚型属于“热”表型。 

综上所述，CCCRC系统进一步细化了实体肿瘤的三类免疫分类系统，符合四类免疫分类系统：“热”、“冷”、“免疫排斥”和“免疫抑制”表型。  

图2. CCCRC亚型之间的组织学特征差异

图2-补充. CRC H&E WSI八种组织分类模型性能

3. CCCRC亚型的生物学特征差异

研究进一步使用基因组、表观遗传、转录组和蛋白质组数据，分析了CCCRC亚型之间生物学特征的区别。基因组结果显示，与其他亚型相比 C4 亚型的 TMB 和新抗原评分最高，染色体不稳定性 (CIN) 发生率最低；C1亚型中已报道的与CRC发生发展相关（APC（85.8%）、TP53（64.9%）和KRAS（46.7%））的突变频率最高。作者进一步计算了每个 CCCRC 亚型中致癌通路突变样本的比例， C4亚型在细胞周期、HIPPO、MYC、NOTCH、PI3K、TGFB 和 RTK-RAS 途径中突变频率最高。CRC和正常组织之间差异甲基化基因（DMG）的分析表明，C4亚型表现出广泛的高甲基化，与其他亚型相比，CpG岛甲基化表型（CIMP）的频率最高。转录组差异分析以及通路富集结果表明，与C3亚型相比，C4亚型的显著上调基因在免疫相关通路上显著富集，而C3亚型则高度富集于TGF-β信号传导、EMT和血管生成等肿瘤发生发展相关通路。

综上所述，CCCRC 亚型之间在DNA 甲基化、基因表达和蛋白质水平的相似/差异，突出了四种亚型在的生物学模式上的异同。

图3. 基于多组学数据的结直肠癌综合分型（CCCRC）亚型的生物学特征描述  

4. 非遗传性肿瘤演化模式

研究继续探索了四种CCCRC亚型间是否存在一种主导的演化模式。通过分析四种亚型之间的显著上调和下调的DMGs（FDR<0.05）、DEGs（FDR<0.05）和DEPs（p-value<0.5）的并集以及交集，探索潜在的演化模式。通过UpSet图，研究者根据差异表达方向趋势，发现可能存在C1向C4、C2、C3依次演化的进展模式（图4A–C）。

图4. 非遗传性肿瘤演化模式的发现

5. CCCRC亚型之间T细胞功能差异

研究者进一步通过单细胞测序数据分析了不同CCCRC亚型之间T细胞功能的差异，结果显示，C2亚型确实表现出比C4亚型表现出更多的免疫抑制作用，这与bulk RNA-seq分析结果基本一致。

图5. T细胞功能差异分析

6. CCCRC分型的的临床特征分析

研究者进一步探讨了不同CCCRC亚型是否能预测治疗效果。结合不同的公共数据的患者临床特征以及治疗方式，K-M生存分析结果显示C1亚型可能受益于化疗和抗EGFR治疗，而C2亚型可能受益于基于5-FU的化疗和贝伐珠单抗的联合治疗，但没有证据表明C3亚型会受益于这些治疗治疗。除此之外，免疫治疗列 IMvigor210和Jung队列的结果显示，C4亚型患者预后最好，而C3亚型患者预后最差（图6J，K）。

图6. CCCRC对指导CRC的临床治疗的重要性

7. 空间转录组分析

最后，研究者重新分析了两个CRC空间转录组（ST）数据集，以探索四个CCCRC亚型的肿瘤细胞、T细胞和间充质细胞之间的空间分布关系。使用"ssGSEA"方法来量化每个点位上6种细胞亚群的富集评分，并可视化排名前25％匹配的点位（图7 A、B）。在Cytassist样本中，作者观察到四个亚型的肿瘤细胞有不同的空间分布模式（图7B）。

图7. 空间转录分析展示

讨论

肿瘤微环境在动态调节肿瘤进展和影响治疗结果方面的关键作用已经得到广泛认可，针对肿瘤微环境的治疗策略已成为癌症治疗的一种有前途的方法。对肿瘤细胞和肿瘤微环境之间相互作用的全面解剖可能揭示新的肿瘤生物学概念并确定治疗靶点，最终实现精准的医学治疗。本文收集了肿瘤细胞和肿瘤微环境的分子特征，重构了全肿瘤组成，并进行了集成分析以了解肿瘤微环境。四个CCCRC亚型具有明显的分子和组织病理学特征，在治疗效果及预后存在明显差异。鉴于本研究使用的scRNAseq和ST数据相对较小，后续依然需要更大的数据集进行验证和深入挖掘，更好地描述个体化TME的复杂性。

END 

参考文献：   [1]  Wu X, Yan H, Qiu M, Qu X, Wang J, Xu S, Zheng Y, Ge M, Yan L, Liang L. Comprehensive characterization of tumor microenvironment in colorectal cancer via molecular analysis. Elife. 2023 Jun 2;12:e86032. doi: 10.7554/eLife.86032. PMID: 37267125; PMCID: PMC10238095.   撰写丨qxp   编辑、排版丨SX   

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