秀丽隐杆线虫神经系统在麻醉和苏醒期间信息含量的测量

翻译：首都医科大学附属北京朝阳医院 麻醉科 王晶

首都医科大学附属北京朝阳医院 麻醉科 魏昌伟

编辑视角  

关于该主题我们已知的内容：  

1、全身麻醉引起的不同大脑状态之间的转换是依赖于神经网络信息流以及内容动态变化的。

2、熵可对特定信号的整体信息含量进行量度，可用于研究中枢神经系统的通信。

3、全身麻醉下神经信息流及内容如何变化仍是一个亟需探索的问题。

这篇文章告诉我们哪些是新知识：  

1、通过在同步成像的神经元中测量秀丽隐杆线虫的钙瞬变熵，可以评估异氟醚麻醉对神经元间信息耦合的影响。

2、本研究构建了三个新的熵指标：分别是状态解耦、内部可预测性和系统一致性。

3、与互信息和传递熵等标准指标相比，这些新指标在区分秀丽隐杆线虫清醒状态和异氟醚麻醉状态方面具有显著优越性。

摘要  

背景  

麻醉是指个体行为和反应受到抑制的一种状态。在人类中，麻醉可引起脑电图的特征性变化。然而，脑电图一类的监测设备无法有效揭示麻醉药物如何在神经元及神经回路水平发挥作用，以及如何影响神经元之间的信息传递。这项研究评估了基于熵的指标是否可以区分秀丽隐杆线虫的清醒和麻醉状态，并评估此类指标是否可在神经元间通信水平上表征麻醉苏醒。

方法  

本研究应用高分辨率钙荧光成像技术监测秀丽隐杆线虫大部分神经元在不同浓度的异氟烷麻醉状态以及麻醉苏醒期间的实时变化。此外，通过计算神经元间通信的广义模型，根据经验推导出新的熵指标，用以区分清醒和麻醉状态。

结果  

这项研究在熵的基础上推导出三个新的指标，用于区分清醒和麻醉状态（异氟醚，n = 10），并对此提供了合理的生理学解释。麻醉引起状态解耦增加（0%：48.8 ± 3.50%; 4%：66.9± 6.08%；8%：65.1 ± 5.16%；0% vs. 4%， P < 0.001; 0% vs. 8%， P < 0.001），而内部可预测性（0%：46.0 ± 2.94%；4%：27.7 ± 5.13%；8%：30.5 ± 4.56%；0% vs. 4%， P < 0.001；0% vs. 8%， P < 0.001 ） 和系统一致性（0%：2.64 ± 1.27%；4%：0.97 ± 1.38%；8%：1.14 ± 0.47%；0% vs.4%，P = 0.006；0% vs.8%，P = 0.015）降低。在秀丽隐杆线虫从中度麻醉逐渐苏醒到清醒状态（n = 8），这些新指标也恢复到基线水平。本研究的结果表明：在异氟烷麻醉后的苏醒早期，秀丽隐杆线虫的神经元特征显示出高频活动的快速消退（n = 8，P = 0.032）。然而，基于熵指标的互信息和转移熵并不能很好地区分清醒和麻醉状态。

结论  

与现有指标相比，基于新算法推导出的熵指标可以更好地区分清醒状态和麻醉状态，同时提示在不同状态之间神经元的信息传递特征具有显著的差异。

背景  

信息论可计算信息在系统中的存储或共享方式。如果我们将神经系统概念化为信息处理系统，那么信息论的指标也可用于研究神经元的动力学和状态。克劳德·香农 (Claude Shannon)于 1948 年发表了信息论的开山之作“通信的数学原理”，奠定了信息论的基础。香农建立了一种与系统无关的范式来分析信息传输。此范式目前是所有现代数字通信和机器学习的基础 。此外，这个范式已被应用于研究神经科学和麻醉中的生物信息编码。香农将“熵”概念化为一个给定信号所包含的总体信息含量的度量指标，这对研究神经系统内的通信尤其重要。熵可测量单个信号的信息内容，基于此也可推导出进一步的指标来量化两个信号之间的信息传递。互信息量化两个信号之间共享的信息内容，而转移熵则衡量信息从一个指定信号到另一个信号的时间依赖性传输。

全身麻醉的特点体现为不同大脑状态之间的转换。既往通过脑电图(EEG) 和功能性磁共振成像，以及观察模型生物体（如黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫），对这一现象进行了深入研究。相似浓度的吸入性麻醉剂几乎会对所有多细胞生物发挥麻醉效应。然而，神经元如何在神经系统或局部网络水平上改变大脑通信的作用机制仍不明确。目前主流假说认为麻醉使得神经元之间失去协调性，从而导致生物体对刺激无法做出反应。互信息和转移熵用于研究麻醉状态，但使用现有指标的前提是已经对麻醉下信息转移如何变化做出了预测。本研究通过使用新的时间依赖性信息传递广义模型解决这一局限，并假设这种方法应用于分析秀丽隐杆线虫头部神经节多神经元活动的数据，可有效区分动物的清醒和麻醉状态，并可进一步表征神经系统恢复到清醒状态的特征。

材料与方法  

秀丽隐杆线虫品系（C. elegans Strains）  

所有实验均在雌雄同体的转基因成虫QW1217 （zfIs124[Prgef-1::GCaMP6s];otIs355[Prab-3::NLS::tagRFP]）上进行。该品系神经元广泛表达GCaMP6s、荧光钙报告基因和核定位红色荧光蛋白。线虫于 20°C 下在线虫生长培养基上培养，该培养基接种了大肠杆菌 OP50。

神经元活动的成像  

通过双倒置选择性平面照明显微镜（美国应用科学仪器公司）和水浸式0.8 NA 40× 物镜（美国尼康）来捕获线虫头部神经节中GCaMP6和红色荧光蛋白的荧光。分别使用5-mW 488-nm和561-nm激光器( Vortan Laser Technology, USA)激发GCaMP6s和红色荧光蛋白。每个荧光通道（GCaMP6s和红色荧光蛋白）的体积以2 Hz的速率获得。将动物固定在渗透性的水凝胶垫中进行成像，该水凝胶垫由Advanced Bio Matrix（美国）生产的13.3％聚乙二醇二丙烯酸酯和Sigma-Aldrich（美国）生产的0.1％Irgacure组成。使用紫外光对含有待成像动物的19个水凝胶垫进行照射，以在硅烷化玻璃盖片上得到影像。然后，将盖玻片真空固定在50毫米培养皿底部，加入50mlS-基础缓冲液（含100毫M NaCl，50毫M KPO4缓冲液和5μg/ml胆固醇）作为浸润介质。向缓冲液中添加5mM四咪唑以进一步固定动物。

神经元活动的提取  

针对每只被成像的动物，我们使用核定位红色荧光蛋白荧光团追踪其头部区域中的 120 个神经元，并利用细胞质 GCaMP6s 神经荧光的波动，提取这些神经元的活性。这一跟踪和提取过程在马萨诸塞州绿色高性能计算中心实施的大规模并行计算中完成，使用的计算技术源自Awal等人既往的工作。

我们假设一个神经元的活动状态可以用其胞体中瞬时钙浓度来近似。然而，在功能网络中，神经元的状态空间实际上要复杂得多。此外，在信号状态空间不完全可视的系统中使用信息论存在局限性。例如，钙荧光不能报告麻醉下神经元的潜在相关特性，如内吞活性水平。此外，整个神经系统的状态是否可以表示为单个神经元状态的串联仍然未知，由于技术限制和理论知识空白，我们做出这些基本假设。

异氟醚麻醉对秀丽隐杆线虫的影响  

在室温下，接触异氟烷的秀丽隐杆线虫会被麻醉，其最低肺泡浓度(MAC)约为3%。当温度为17℃时，异氟烷在肌肉和脂肪等组织中的溶解度是37℃时的2.3倍，因此需要吸收更多的异氟烷才能在较低温度下产生类似的化学势能梯度。因此，就物理化学角度而言，17°C时3%浓度的异氟醚与37°C时1.3%浓度的异氟醚在药效学上相似。利用两个实验方案评估了线虫神经元对异氟醚暴露的反应变化：逐步麻醉和麻醉苏醒。

逐步麻醉  

在逐渐平衡到0%、4%和8%的大气异氟醚后，从每只动物（n=10）采集三段5分钟的神经元活动。麻醉浓度分别对应于1.3和2.6 MAC，分别用于达到中度和深度麻醉。在实验开始后的30min、150min和270min时，分别以0%、4%和8%的异氟烷水平进行成像。通过更换浸泡介质为新鲜的S-基础缓冲液，再用移液的方式分别加入13或26μl异氟烷，分别达到4%和8%的异氟烷水平。在成像序列之间的时期内，使用红外光谱仪（Ohmeda 5250 RGM；GE Healthcare，美国）进行连续监测，并根据需要通过注射泵滴入异氟烷以维持目标浓度。

麻醉苏醒期  

将秀丽隐杆线虫（n=8）封装并浸入50ml S-基础缓冲液中时，在麻醉前状态（即异氟烷0%）成像10分钟。随后，将 49 ml 缓冲液从培养皿中取出并保留，每只动物浸入 1 ml 缓冲液中，在 4% 异氟醚下麻醉维持120 min。然后，打开培养皿，重新加入 49 ml 缓冲液，从而立即将异氟醚的缓冲浓度降低到其先前水平的 1/50。稀释缓冲液后立即开始记录120min的神经元活动，捕捉每只动物从麻醉状态中苏醒的情况。对照组（n=8）在稀释后神经元活动记录开始前，让动物在室内空气中休息120min。

统计方法  

神经元活动轨迹的标准化  

在逐步平衡方案记录中，对于每只动物的所有三个麻醉浓度记录（0%、4%、8%），神经元活动强度都是根据0%异氟烷记录中所有神经元和时间点的平均强度进行标准化的。对于来自苏醒状态的记录，每个记录中的神经元活动强度都被标准化为该记录中所有神经元和时间点的平均强度。由于动物被固定并封装在水凝胶中进行成像，因此无法标准化至觉醒等其他行为终点。

信号功率和频谱密度分析  

在逐步平衡实验中，需计算每只动物中每个神经元痕迹的信号功率，并根据不同暴露条件（0%、4% 和 8% 异氟烷）进行平均。采用单因素方差分析和双尾独立样本t检验比较均数。使用全变分正则化方法，计算每个 120 min长的记录中每个神经元痕迹的时间差，并通过傅立叶变换计算连续 12 min时间段的功率谱密度。通过对所有 120 个神经元的功率谱进行平均，得到每个时期每只动物的平均功率谱，并计算累积功率谱和中值功率频率。使用双尾独立样本 t 检验比较了暴露于 4% 异氟醚的动物和对照动物之间平均光谱中值频率的差异。

统计学显著性定义为P<0.05，使用P<0.01和P<0.001进一步区分结果显著性。我们没有对实验动物的样本量进行正式的先验功率计算；既往使用该动物模型的经验表明，目前的动物数量足以检测显著性差异。数据分析使用了MathWorks公司的MATLAB（美国）软件进行。

熵计算与衍生度量  

熵可直观衡量给定信号中包含的信息量，适用于由一连串离散状态组成的任何信号。当信号中所有可能的状态以相等概率出现时，信号的无序程度最大，此时熵被最大化。熵也可表示信号中不可预测性的程度。对于多个信号，联合熵则衡量这些信号熵的总和。互信息是由香农（Shannon）提出的，随后由法诺（Fano）和霍金斯（Hawkins）命名，用于表示两个（或多个）信号之间的相互依赖。互信息通常被用来量化和建模神经信号之间从单位尖峰到脑电图的一致性，它也可以被理解为一个信号提供的关于另一个信号的信息量。在附录中，熵的基本数学细节、联合熵和互信息进行了回顾，并附有有价值且可扩展的图形类比。

转移熵是一种具有方向性且和时间相关的量度。在由 X 和 Y 构成的系统中，从 X到 Y的转移熵（TEX→Y）表示在 X 的过去和 Y 的未来之间共享的信息量，但不包括 Y 的过去。因此，它衡量的是 X 的过去如何影响到 Y 的未来。这种时间依赖性要求将每个信号分为过去和未来，因此 X 和 Y 的双信号模型变成了四信号模型，分别为XP 和 XF（X 的过去和未来）以及 YP 和 YF（Y 的过去和未来）。四信号模型由XP、YP、XF和YF组成，表示了这些信息内容之间的关系。这些关系可以用包含15个离散编号区域的四组维恩图（如图1A所示）的交集来表示。图1B显示了X和Y之间的过去的互信息，其中包括区域3、7、11和15中的信息之和。信号X到信号Y的传递熵TEX→Y可以理解为XP与YF的交集和YP的补集的交集（如图1C所示）中的信息：X的过去信息与Y的未来共享，而与Y的过去信息不共享，因此是区域9和区域13信息的总和。这些等效熵和集合由严格的形式代数连接在一起。方便起见，表1显示了每个设定区域与XP、YP、XF和YF的联合熵之间的转换。因此，因此，区域1中的信息量(即XP中未与任何YP、XF和YF共享的信息量)由H(XP,XF,YP,YF) - H(XF,YP,YF)提供。TEX→Y表示为区域9和13的总和，其中包含为H(XP,YP) +H(YP,YF)-H(XP,YP,YF)-H(YP)。一旦用图示说明，我们能够清晰地看到的指标就不仅仅局限于互信息或传递熵等已有的指标，还能够在清醒和麻醉状态下的神经元对之间自由挑选四信号模型的15个区域的任何相加组合。因此，我们可以根据经验构建新的指标，这些指标有可能更好地表征在麻醉状态下神经元之间的信息传递是如何改变的，从而明确其生理学机制。零假设是在不同麻醉水平下，熵测量不会有显著差异。同样地，零假设也适用于在不同麻醉水平下进行熵计算的分组（例如，互信息、传递熵），即它们也不会有显著差异。

图1：神经元对之间基于熵的信息传递的四信号模型。(A)两个X源和Y源所包含过去和未来信息的四信号模型维恩图。15个区域分别用值为1、2、4、8的XP、YP、XF、YF的数值组合进行编号。区域颜色是根据区域1、2、4和8中显示的底色的阴影组合来分配的。(B)互信息的熵值，表示X源和Y源的过去状态间共有的信息。维恩图上对应于区域XP和YP的交集，即区域3、7、11和15的交集，表示为XP∩YP，因此其包含信息内容为H(XP) + H(YP) - H(XP,YP)。(C)转移熵，表示在Y源的未来状态(YF)中储存的信息，可以从X源的过去状态(XP)中预测，但不能从Y源的过去状态(YP)中预测，因此代表信息从X到Y的因果传递。对应于XP和YF的交集，而非YP和XP的交集所包含的区域。即包含区域9和13。表示为XP∩(YF∩YʹP),因此其包含的信息量为H(XP,YP) + H(YP,YF) - H(XP,YP,YF) - H(YP)。 表 1. 从信息区域组合到熵度量组合的转换表  

秀丽隐杆线虫在稳定麻醉状态下的四信号模型 

四信号模型需要秀丽隐杆线虫神经元活动数据的连续轨迹被离散成一组量化的活动状态。使用Otsu算法导出的最佳阈值将GCaMP荧光数据量化为四个级别，从而在每个动物的每个成像时间产生每个神经元的两位值。针对每只动物，使用了相同的阈值(0%、4%和8%异氟烷)。使用Otsu算法对每只动物重新计算阈值，这补偿了动物之间荧光团表达的实验差异或光照强度等问题。之所以选择这种量化方案，是因为既往使用这种方法取得了成功。X和Y是从提取活动的120个神经元池中抽取的任意一对神经元，从而产生14,400对神经元，其中XP, YP, XF和YF是通过时移1 s(即两个样本)产生的。这个四信号模型可以评估一个神经元信号(即XP)预测同一信号(XF)或另一个神经元信号(YF)下一个1秒的趋势。熵含量也被标准化为联合熵H(XP,XF,YP,YF)，它对应于所有15个区域或XP∪XF∪YP∪YF的和;这使得熵的比例分布可以独立于处理条件下总熵的变化进行分析。我们比较了互信息、传递熵和新定义指标的熵分布，通过汇集每个动物在麻醉暴露条件下所有可能的神经元对的熵含量，并通过方差分析比较不同条件下每个信息区域的平均熵含量，并通过Tukey-Kramer调整进行多重比较。

秀丽隐杆线虫在麻醉苏醒期间的四信号模型

互信息、传递熵和其它新指标同上一节计算相同，但在120min麻醉恢复期间神经元活动数据的±2min(即±240个样本)移动窗口下计算。使用移动平均算子对平均时间过程进行时间平滑，以更好地显示数据的趋势，同时抑制叠加的周期变化，并计算平均时间过程的95% 置信区间。

结果

异氟烷暴露抑制神经活动功率以及总熵值

图2A：a-c分别显示了将GCaMP6s转基因秀丽隐杆线虫分别暴露在0%、4%、8%的异氟烷下，其神经元活动的变化。与未麻醉的对照组相比，异氟烷暴露的秀丽隐杆线虫平均信号功率显著降低。经过离散化后，总熵值也随着麻醉暴露浓度加深而降低。总结来说，较低的神经元激活水平会导致可连接的神经元数量显著减少，熵值降低。Fig 2A(d-e)：异氟醚暴露抑制神经元活动信号的功率和熵值。

异氟烷暴露早期可出现高频光谱位移特征

此前已有研究证实，当秀丽隐杆线虫暴露于4%的异氟烷时，其神经元活动的平均光谱功率会转向较高的频率。在图2中，这种变化更为明显。相较于无异氟烷，暴露于4%异氟烷的秀丽隐杆线虫神经活动的平均信号功率和总熵值均较低，但表现出更加不稳定、波动更加剧烈的活动趋势。这种变化似乎表明，在基线非麻醉状态时网络神经元之间是有序激活和失活的状态，而在异氟烷麻醉状态下，转向网络协调性差，变化速度快的状态。

图2B 表明异氟烷吸入浓度从4%降至0%时秀丽隐杆秀丽隐杆线虫的神经元活动。在吸入4%异氟烷0.2小时后与对照组相比，神经元高频活动大大增加。图2B(b)表明暴露于4%异氟醚线虫的神经元活动随时间的变化。然而，这种现象在麻醉苏醒过程中迅速消散，在未经麻醉和从4%异氟烷麻醉中恢复0.8h后，神经元功率谱未见明显差别。图 2B(c)表示分别暴露于0%和4%异氟醚的线虫在麻醉后0.2h/0.8h的神经元功率谱变化。这些结果通过测量恢复期每个0.2小时的中位数功率频率进一步量化了这一结果（n = 8 从 4% 异氟醚苏醒，n = 8，对照）。与对照组相比，暴露于4%异氟醚0.2小时的秀丽隐杆线虫其中位功率频率显著升高(图2B，d;双尾独立样本t检验，P = 0.032)，此时间点后各组间无显著差异。 图2B(d)表示分别暴露于0%和4%异氟醚的线虫在麻醉后随时间变化的中位功率频率。

图2：异氟醚暴露会抑制神经元活动信号的功率和香农熵。

其早期特征是神经元活动的平均频谱功率向更高频率移动。(图2A，a-c)显示秀丽隐杆线虫头部的120个神经元分别在0%、4%和8%异氟烷的麻醉中平衡的时的荧光光学活性。颜色表示在每个跟踪的神经元核周围的细胞质壳中标准化的GCaMP6s荧光活性。（图2A，d)在异氟烷浓度增加的情况下，总信号功率下降。记录动物在室内空气或4%或8%异氟醚环境下神经元活动轨迹的平均信号功率±SD。(图2A，e)显示秀丽隐杆线虫在空气或4%或8%异氟烷的动物中记录的量化神经元活动轨迹的平均香农熵±SD。(图2B，a和b)显示秀丽隐杆线虫头部神经节120个神经元在异氟醚暴露前和从4%异氟醚平衡状态中恢复超过120min时的神经元活动轨迹。(图2B，c)指暴露于室内空气或4%异氟烷后0.2和0.8小时，神经元活动的平均功率谱密度。(图2B，d)表示暴露后12min计算的动物在室内空气或4%异氟烷平衡下神经元活动的平均频谱中位数±SD。

异氟醚麻醉显著改变分布熵  

在不同浓度异氟烷暴露水平下（0%、4%、8%），对所有秀丽隐杆线虫的全部神经元计算每个信息区域比例熵平均值，如图3所示，区域的编号和颜色与图1A一致。为了进行比较，补充图S1A显示了这些区域间熵含量的绝对分布(这也反映了随着麻醉程度的加深，总熵的下降)。补充图S1B 显示了基于另一种算法的熵的比例分布，这种算法更强调神经元活动的时间过程，而代价是将神经元活动水平更粗略地量化。 在秀丽隐杆线虫接受4%、8%异氟烷麻醉时，信息区域1、2、4和8的比例熵显著升高，这代表了四信号模型(XP, YP, XF, YF)中每个信号所包含的信息量与其他三个信号中的任何一个都不共享。在麻醉状态下，信息区域5和区域10的比例熵含量显著降低，表明神经元的过去状态(XP或YP)可预测其未来状态(分别为XF或YF)的信息量，这些信息完全独立于另一个神经元(分别为Y或X)中的信息（与当前信息在另一个神经元中（分别为 Y 或 X）的情况无关）。最后，我们观察到麻醉下15区的比例熵也较低;这个区域直观上包含XP∩XF∩YP∩YF这四个信号共享的信息。针对这些结果，我们可以通过对麻醉动物中观察到的熵含量改变的信息区域进行分组来经验地构建和命名新的指标，这些信息区域的分组对麻醉状态下信息传递如何改变具有概念意义。

图3：异氟醚显著改变了四信号信息传递模型中的熵分布。

图3显示了暴露于室内空气或4%或8%异氟醚(n = 10)的四信号信息传递模型中信息区1至15的平均熵含量±SD。计算每只动物(14,400对神经元/动物/暴露条件)记录的每对神经元的熵含量，标准化为四信号模型的总熵值，然后按暴露条件取均值。

这三个指标分别是:  

•状态解耦：包括区域1、2、4和8用以描述仅在信号XP, YP, XF, 和YF中的一个信号中存在的信息量，从而描述了神经元彼此和自身解耦的程度。

•内部可预测性：包括区域5和区域10用以描述神经元的过去状态在独立于其他信息来源的情况下预测其未来行为的程度。

•系统一致性：仅包含区域15就代表了在X源和Y源的过去和未来都包含的信息量，因此也代表了系统在状态改变时保持一致状态的程度。该指标类似于多信息概念的全系统扩展。例如，之前曾在构成秀丽隐杆线虫运动回路的限制性神经元组内进行测量，且该神经元组有明确的定义。

现有指标难以区分清醒状态和麻醉状态

图 4A(a)、图4B(b)指异氟烷麻醉下代表互信息和转移熵的维恩图。上述指标是对暴露于逐步平衡的0%、4%和8%异氟醚(n = 10)的秀丽隐杆线虫中所有可能的功能神经元计算的。麻醉状态与对照组的互信息无统计学差异(图4A, b;0%异氟烷:3.67±1.35%，4%异氟烷:2.26±1.71%，8%异氟烷:2.29±0.83%;方差分析，P = 0.043;Tukey–Kramer 0% vs. 4%;P = 0.069, Tukey-Kramer 0% vs. 8%，P = 0.075)。研究发现，相较对照组，4%异氟醚暴露状态下的传递熵升高(图4B，b;0%异氟烷:0.58±0.08%，4%异氟烷:0.98±0.27%，8%异氟烷:0.71±0.34%;方差分析，P = 0.004;Tukey-Kramer 0% vs. 4%，P = 0.004;Tukey-Kramer 0% vs.8%，P = 0.483)，但在8%异氟醚暴露状态未观察到传递熵的变化。相比之下，图4 (C至E)显示了状态解耦、内部可预测性和系统一致性的图形表示和熵，以及异氟醚麻醉对这些新指标的影响。 相较于对照，4%和8%异氟醚暴露组的状态解耦都有所升高，且差异具有高度的统计学意义且具有高度显著性(图4C，b;0%异氟烷:48.8±3.50%，4%异氟烷:66.9±6.08%，8%异氟烷:65.1±5.16%;方差分析，P < 0.001;Tukey-Kramer 0% vs. 4%，P < 0.001;Tukey-Kramer 0% vs. 8%，P < 0.001)，而相较对照组，4%和8%异氟醚组的内部可预测性都受到抑制，差异具有高度的统计学意义 (图4D, b组;0%异氟烷:46.0±2.94%，4%异氟烷:27.7±5.13%，8%异氟烷:30.5±4.56%;方差分析，P < 0.001;Tukey-Kramer 0% vs 4%， P < 0.001;Tukey-Kramer 0% vs. 8%， P < 0.001)。相对于对照组，在4%和8%的异氟烷暴露下，系统一致性度量(作为多信息的概括)也被显著抑制(图4E，b;方差分析，0%异氟烷:2.64±1.27%，4%异氟烷:0.97±1.38%，8%异氟烷:1.14±0.47%;P = 0.004;Tukey-Kramer 0% vs. 4%， P = 0.006;Tukey - Kramer 0% vs. 8%， P = 0.015)。图 4C(a-b)、图4D(a-b)、图4E(a-b)分别指异氟烷麻醉下代表状态解耦、内部可预测性和系统一致性的维恩区域及其计算方程。

图4:麻醉状态可以通过神经元对之间基于熵的信息传递度量的变化来表征。

(图4 A-E，a)四信号模型中选择的信息区域集群代表信息理论度量:互信息、传递熵、状态解耦、内部可预测性和系统一致性。彩色的维恩图表示组成每个度量的组合信息区域。(图4 A-E，b)从暴露于室内空气或4%或8%异氟烷的动物记录的神经元活动轨迹对中所选信息区域簇的比例熵含量±SD。

基于熵的新指标可以良好表征异氟醚麻醉后的苏醒

在120min麻醉苏醒期的时间窗口下对所有可能的功能神经元进行(n = 8， 4%异氟醚，n = 8，对照)互信息、传递熵、状态解耦、内部可预测性和系统一致性的计算。然后分别计算这些指标的平均值，如图5所示，在麻醉恢复期间每个指标使用95% CI的平滑曲线表示(紫色条带为4%异氟烷出现，灰色条带为对照)。我们观察到，在4%异氟醚麻醉下和对照组之间的每个指标的分离程度与稳定麻醉水平下的等效测量相比较。因此在所有五个评估指标的成像期间，平均值的分离得到解决。然而，互信息和传递熵均值的分离(图5，A和B)很小，任何差异在时间轴早期即被消除。图5C中的状态解耦指标和图5D中的内部可预测性指标，在麻醉条件和对照条件之间存在明显的区别。这些差异在麻醉开始苏醒后的一个多小时内逐渐减少。系统一致性(图5E)始于均值分离的较小但清晰的差异，并且似乎沿着时间线差异逐渐减少，这与图2B（d）中所示的更经典的中值功率频率测量时间线最为一致。

在对照组动物中所有指标的平滑曲线可以看到缓慢的漂移。这很可能是一种技术伪影，由GCaMP荧光团在长时间成像下的渐进式光漂白以及在被包裹和固定的秀丽隐杆线虫标本中减少感觉输入和更多静止神经元活动的趋势相结合所引起的。相关研究结果解决了异氟醚暴露组与对照组之间的差异。

图5：动物从异氟醚麻醉中苏醒时，基于熵的神经元对信息传递测量值的变化非线性地恢复到基线水平。这些测量值包括互信息、传递熵、状态解耦、内部可预测性和系统一致性（图5 A-E）。信息区域簇中比例熵含量的时间平滑平均值 ± 95% CI，用来表示4% 异氟醚麻醉苏醒的动物和室内空气暴露对照组的信息传递测量。个体动物计算出每种测量类型的指标，（异氟烷组：n = 8，对照组：n = 8 ）。

基于熵的测量解决了动物从异氟醚麻醉中出现的非线性变化

虽然图5中指标的平均值波段是平滑的，但在短时间尺度内，在异氟醚组和对照组中，个体实验动物的原始信号存在相当大的周期性波动。而趋势可靠地解决了麻醉恢复期间的图像，非线性的发生似乎存是潜在的个体差异。事实上，通过对预试验中显示的神经元痕迹的视觉检查，出现的非线性变化是明显的(图2B，b)，在记录的2h内，动物经历了显著的神经元相对静止和较高神经元活动的时期。

讨论

本研究使用神经元之间信息传递的广义模型建立了一种新的熵度量标准，优于互信息和转移熵。在区分秀丽隐杆线虫的清醒和麻醉状态方面，这种新方法比互信息和转移熵更加有效。与其他方法不同的是，这种方法不只是基于关于麻醉如何影响神经元之间信息传递的预测，而是根据实际测量对新指标进行了概念化。这些新指标包括状态解耦、内部可预测性和系统一致性，能够更好地区分秀丽隐杆线虫的清醒和麻醉状态。 这可以告诉我们麻醉过程中神经元之间的通信是如何变化吗？被麻醉的动物状态解耦的增加合理地描述了单个神经元与其先前状态和周围神经元状态的解耦，这表明在神经元之间的通信水平上，麻醉使神经系统正常功能的诱发出现障碍。这一结果与跨物种的观察结果非常吻合，即麻醉状态与明显的信息解耦有关。同样，麻醉会导致动物神经元之间系统一致性降低，这可以被解释为反作用。随着神经系统被麻醉，神经元之间的信息共享量会减少。此外，即便考虑了任何给定神经元在过去的活动，神经元活动的整体可预测性也会下降。上述后一种效应也可通过麻醉状态下内部可预测性指标的降低所体现。这些新指标的生理学解释必然存在某种一致性。

一个信息区域中相对熵含量的增加必须由其他区域中相对熵含量的减少来弥补。为了保持状态解耦，信息区域中相对熵含量的提升应与内部可预测性和系统一致性区域中相对熵含量的损失相平衡。作者对某些信息区域进行了特定指标分组，以便更清晰地表达和解释麻醉状态和清醒状态之间熵内容分布形状的整体转变方式。本研究中用于解释神经元功能障碍的特定指标若要得以更广泛的应用，还需在其他系统中进一步研究。 考虑到这些因素，值得关注的是：这些影响是否只是由于动物被更深度的麻醉所致，致使单个神经元所含的信息总体上降低。实际上，作者确实观察到，当秀丽隐杆线虫暴露于异氟醚时，单个神经元活动信号的平均熵呈现出剂量依赖性的显著下降，同时伴随着整体活动的抑制。然而，所有基于熵的指标都被归一化为四类模型的总联合熵。因此，观察到的归一化熵含量的变化不能用来解释整体熵含量的变化或任何衍生指标的变化。相反，基于熵的指标的变化反映了熵在不同信息区域之间分布的变化，进而反映了每个神经元对信息内容传递方式的变化。有趣的是，基于熵的指标以二元的方式显著区分清醒和麻醉状态，而评估单个神经元平均行为的指标，如平均熵和平均信号功率，则以分级方式变化。这表明当动物暴露于更高浓度的麻醉时，神经元间通信的中断不仅仅是神经元活动的全局抑制的线性函数。这些指标的不同敏感性提示我们应采用多种方法来对不同的神经状态进行评估。 相比对照组，在异氟醚浓度为4％时，秀丽隐杆线虫的转移熵显著升高，但当浓度提高至8％时则没有。这个矛盾的结果是如何产生的呢？转移熵衡量了一个过程（例如YF）的未来受另一个过程（例如XP）的过去影响的强度，而不受其自身过去（例如YP）的影响。如果过程Y的高频活动和不稳定性增加（即其内部可预测性降低），则事件X比Y自身的过去对Y未来的影响更大。因此，在4%异氟醚时，转移熵可能会增加。当神经系统更加规律化，例如在无异氟醚作用下，以及当神经元活动普遍趋向抑制性，例如在8%异氟醚作用下，转移熵可能都会减少。目前，这项研究存在一个局限性，即未能单独识别神经元。秀丽隐杆线虫作为模型系统的优势之一在于可以利用全面的神经元连接组以及遗传命运映射图谱的可用性，从而成为一种潜在的非常强大的神经元识别方法。

事实上，我们先前使用熵分析了五个神经元回路（AVA、AVB、AVD、AVE和RIM）的手动识别。最新的研究进展表明，利用多色标记的秀丽隐杆线虫神经元的大规模自动识别正迎来应用的高峰。神经元识别技术允许对特定神经元对进行比较，精确识别已知机械连接神经元之间的信息传递，或根据活动对神经元群进行分割。在未来，我们可能会协调麻醉下特定神经元的行为和通过神经元识别和连接组建立的化学和电突触密度。在深度麻醉期间，神经元动力学相对静止，神经元被锁定在特定的激活水平。这是否代表在麻醉的某个时刻被冻结，或者这种模式是否基于异氟醚对底层固定连接组的作用在个体之间再现呢？神经元鉴定将阐明这些合理假设中的哪一个更为正确，这将从根本上影响我们对作用机制的理解。

神经元识别可以帮助我们进一步探究麻醉剂的非线性性质，包括整体神经元静止期。本研究发现麻醉状态使高频活动增多，但一旦这种影响减弱，剩下的是神经元活动受到抑制的时期，偶尔会穿插在激活时期中。这种模式在图2B（b）中十分显著；此模式几乎出现在所有试验组线虫暴露于4%异氟醚时，但在任何对照组中均未出现。此外，我们也发现图5中显示的基于熵的个体试验指标存在明显的短期震荡。众所周知，秀丽隐杆线虫可以进入一种类似睡眠的生理状态，被称作嗜睡期，其特征是身体缺乏运动和整体神经元静止。在这里我们所观察到的广泛神经元静止期似乎与秀丽隐杆线虫中神经元活动模式类似，表明该动物可能会在异氟醚麻醉后进入和退出“睡眠样” 状态。

未来，随着秀丽隐杆线虫成像测定技术的发展，神经元的识别将变得更加准确，这将有助于深入研究睡眠相关神经元的活动。通过测量和识别在麻醉与苏醒期间的特定神经元活动（例如中间神经元RIS），我们将能够更好地理解这一假设。

既往主要依靠分析麻醉志愿者的脑电图和功能性磁共振成像数据来研究人类受试者的工作。但是这些方法只能解决神经系统中区域到区域而非神经元到神经元的通信问题。本研究以更精细的规模将信息理论方法应用于麻醉，结果发现与麻醉降低网络效率的概念基本是一致的。皮层“节点”之间的网络中断可能是由于皮层下的横向网络中断而导致的紧急情况。本研究发现在麻醉苏醒期间，即使存在稳定的趋势，熵指标在对照组和麻醉组的动物中都非常不平滑。神经元之间的信息传递本质上处于快速流动的状态。该发现非常有趣，特别是考虑到通过局部场电位和脑电图测量的动物在暴露于稳态浓度的麻醉剂时，大脑状态之间存在节律性振荡。秀丽隐杆线虫具有编码特定简单行为的瞬态亚稳态，执行不同行为时在这些状态之间不断转换。

在清醒的秀丽隐杆线中，作者在之前重现了这些状态空间，并证明了异氟醚麻醉下丧失了形成这些具有代表性的亚稳态的能力。作者的研究结果进一步证实了从麻醉状态到清醒状态的是一个随机过程。此过程中，神经系统活动的概率会随着时间的推移而增加，与清醒和镇静状态相关。

最近一项研究对临床双谱指数麻醉深度监护仪内部运行规律的演算提示它适用于额叶脑电图的算法。虽然双光谱指数监测器未对熵进行明确定量计算，但在全身麻醉的最常用算法中，可有效利用40-47 Hz低伽马脑电波与0-40Hz功率谱的维纳熵之比进行阐述。虽然秀丽隐杆线虫神经系统和灵长类动物大脑存在巨大规模差异，但我们仍然有理由相信可以使用信息论作为评估麻醉深度监测的合适工具。

研究支持  

本文得到美国国立卫生研究院资助，包括R35 GM145319、NIH R01 GM121457和部门资源。

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